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油和脂肪里的抗氧剂
食品添加剂：直接法
- 液相色谱法
- 适用于培酸丙酯〔PG〕、2，4，5-三羟基苯丁酮〔THBP〕、叔丁基氢醌〔TBHQ〕、去甲二氢愈创木酸〔NDGA〕、2，3-二叔丁基-4-羟基茴香醚〔BHA〕、2，6-二叔丁基对甲酚(Ionox-100)和3，5-二叔丁基-4-羟基甲苯〔BHT〕。
A 原理
将样品溶于正已烷，用乙腈提取其中的抗氧剂。浓缩提取液，用等体积的异丙醇稀释，然后进样到液相色谱仪，用UV〔紫外〕检测器在280nm检测。
B 仪器和试剂
B.a 梯度液相色谱仪
备有10mV条状纸的记录仪，20μl样品环的进样阀和在280nm测量吸光度A的检测器。典型的操作条件：检测器灵敏度0.05AUFS；时间常数，0；温度，室温；流速，2ml/min。
B.b 色谱柱
250×4.6mm〔内径〕，填充有10μm的不锈钢柱或同类品。如有需要，可使用保护柱。如图12-1所示，7个抗氧剂基线均能分离。
B.c 玻璃器皿
所有的玻璃器皿依次用CHCl3、丙酮、MeOH清洗，再用氮气吹干。
B.d 溶剂
乙腈、2-丙醇和正已烷均应在玻璃仪器内蒸馏过。
B.e 流动相
使用LC级溶剂，或同类产品。A.蒸馏水－加5%HOAc。B.乙腈－加5%HOAc。用线性梯度淋洗，在10min内从A中含30%的B淋洗液到含100%B，其中100%B淋洗4min，淋洗速度为2ml/min。仅对样品在用100%B淋洗时增加流速到6ml/min，淋洗5min，或者直到非极性的类脂化合物淋洗出来。对样品和标准在1min内恢复到用A中含30%B的淋洗液以2ml/min流速淋洗，以使基线、压力和流动相组成变得稳定〔约10min〕。进行空白梯度淋洗〔不注射样品〕，此时不应存在对任何抗氧剂测定的干扰峰。如果有不能被消除的小峰存在，所有有关峰高都应校准以消除干扰。
B.f 抗氧剂
BHA〔2-BHA和3-BHA的混合物〕，BHT，TBHQ，Ionox-100，THBP和PG，NDGA。
B.g 标准溶液
避光冷藏所有的抗氧剂溶液。用2-丙醇-乙腈(1+1)配制所有溶液。
B.g.1 贮备液
1mg/ml。精确称取5.0mg每个抗氧剂分别放入50ml容量瓶中，溶解，稀释至刻度，混匀。
B.g.2 标准溶液
0.01mg/ml。(10μg/ml)。用移液管移取1ml贮备液放到100ml容量瓶中，稀释至刻度，混匀。
B.h 提取溶剂
将正已烷和乙腈一起振荡2min，使相互饱和，分层。除另加指定外，在下面的提取过程中均使用这些饱和溶剂。
C 测定
C.a 提取
C.a.1 液体油类
准确称取约20g油，放入50ml烧杯并定量转移到100ml容量瓶里，用正已烷淋洗烧杯并稀释至刻度，混匀。吸取25ml一份溶液放入125ml分液漏斗中，用3份50ml乙腈提取。如果出现乳化现象，将分液漏斗用热自来水淋5－10s以消除乳化。将三份提取液合并收集在250ml分液漏斗中，再慢慢放到250ml圆底烧瓶中，以去除正已烷-油滴。注意：此时，150ml乙腈提取液可以在冰箱中放置过夜。$$用快速蒸发器于小于等于40℃的水浴上在10min内将溶液蒸发至3－4ml。注意：如果延长蒸发时间TBHQ可能损失。可使用高效的真空和冰水冷却系统来减少蒸发时间。用移液管将乙腈-油剂混合液转移到10ml具玻璃塞量筒中。用少量未经饱和的乙腈淋洗烧瓶，用移液管转移淋洗液到量筒内，共收集5ml。用少量2-丙醇淋洗移液管，并继续淋洗瓶子，将全部淋洗液转移到量筒内，直到准确收集到10ml为止。混匀量筒中的溶液。注意：在样品溶液制备好后应昼减少分析时间，因为TBHQ可能损失。
C.a.2 猪油或起酥油
准确称取约20g油，放入50ml烧杯并定量转移到100ml容量瓶里，用正已烷淋洗烧杯并稀释至刻度，混匀。吸取25ml一份溶液放入125ml分液漏斗中，用3份50ml乙腈提取。如果出现乳化现象，将分液漏斗用热自来水淋5－10s以消除乳化。将三份提取液合并收集在250ml分液漏斗中，再慢慢放到250ml圆底烧瓶中，以去除正已烷-油滴。注意：此时，150ml乙腈提取液可以在冰箱中放置过夜。$$用快速蒸发器于小于等于40℃的水浴上在10min内将溶液蒸发至3－4ml。注意：如果延长蒸发时间TBHQ可能损失。可使用高效的真空和冰水冷却系统来减少蒸发时间。用移液管将乙腈-油剂混合液转移到10ml具玻璃塞量筒中。用少量未经饱和的乙腈淋洗烧瓶，用移液管转移淋洗液到量筒内，共收集5ml。用少量2-丙醇淋洗移液管，并继续淋洗瓶子，将全部淋洗液转移到量筒内，直到准确收集到10ml为止。混匀量筒中的溶液。注意：在样品溶液制备好后应昼减少分析时间，因为TBHQ可能损失。
C.b 色谱法
准确称取约20g油，放入50ml烧杯并定量转移到100ml容量瓶里，用正已烷淋洗烧杯并稀释至刻度，混匀。吸取25ml一份溶液放入125ml分液漏斗中，用3份50ml乙腈提取。如果出现乳化现象，将分液漏斗用热自来水淋5－10s以消除乳化。将三份提取液合并收集在250ml分液漏斗中，再慢慢放到250ml圆底烧瓶中，以去除正已烷-油滴。注意：此时，150ml乙腈提取液可以在冰箱中放置过夜。$$用快速蒸发器于小于等于40℃的水浴上在10min内将溶液蒸发至3－4ml。注意：如果延长蒸发时间TBHQ可能损失。可使用高效的真空和冰水冷却系统来减少蒸发时间。用移液管将乙腈-油剂混合液转移到10ml具玻璃塞量筒中。用少量未经饱和的乙腈淋洗烧瓶，用移液管转移淋洗液到量筒内，共收集5ml。用少量2-丙醇淋洗移液管，并继续淋洗瓶子，将全部淋洗液转移到量筒内，直到准确收集到10ml为止。混匀量筒中的溶液。注意：在样品溶液制备好后应昼减少分析时间，因为TBHQ可能损失。
D 计算
抗氧剂的浓度计算如下：$$抗氧剂，ppm＝〔R/R')×〔Cs/Wx〕×D $$式中R和R'＝分别表示样品和标准的峰高；Cs＝以μg/ml表示的标准试液的浓度；Wx＝在10ml最后的提取液中含有的以g/ml表示的样品重。D＝稀释因子，如果被测定的溶液稀释过的话。
