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蛋中的β-羟基丁酸、乳酸和琥珀酸
蛋和蛋制品
- 气相色谱法
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A 试剂
A.a 三氟化硼-1-丙醇溶液
10%。制备如下：在通风橱里，按下列顺序或按与此相当的气路顺序安装，一前一后连接到有几节短聚四氟乙烯管的BF3气瓶，把250ml PrOH转入瓶底，称重，并在冰浴中冷却，把冰浴中的瓶连接到气路中，慢慢将BF3气泡鼓入PrOH直到吸收22g为止〔在放入管子之前，到从PrOH取出，玻璃管必须一直通以BF3，如果加入的BF3超过22g，用PrOH稀释到PrOH的总毫升为11.4×g BF3。试剂贮存在玻璃具塞瓶中，放入冰箱。$$市售试剂14%(w/v)，不加稀释即可用，也可用1vol+0.6vol PrOH稀释液，注：要用有效的排风设备除去BF3蒸气，以免接触到皮肤，眼睛和呼吸系统。
A.b 乳酸钙标准溶液
当天新配。把0.856g USP乳酸Ca·5H2O溶于H2O，稀释到100ml〔溶液A：5.0mg乳酸当量/ml〕，用H2O分别将25，20，15和5ml溶液A稀释到50ml，配制含量为2.5(B),2.0(C),2.0(C),1.5(D)和0.5(E)mg乳酸当量/ml的溶液。
A.c 琥珀酸标准溶液
当天新配。将1.000g琥珀酸溶于H2O，并稀释到100ml〔溶液F：10.0mg/ml〕。分别将25，25和15ml溶液F用H2O稀释到50，100和100ml，配制含5.0(G) , 2.5(H)和1.5(I)mg/ml的溶液。
A.d 苯乙酮〔AP〕溶液
A.d.1 标准溶液
把0.800g苯乙酮溶于PrOH，并在容量瓶中稀释到100ml，室温下保存。
A.d.2 稀释溶液
当天新配。移取20ml PrOH，10ml AP标准溶液I和20ml CHCl3放入125ml分离器〔若GC系统不能使用CHCl3，可用醚代替。然而用醚进行色谱分离，必须在酯化作用后24h内进行〕。加40ml饱和的(NH4)2SO4溶液，塞好，摇动分离器1min，使液层分开，排出底部的水层，弃去，将上层转入玻璃塞细口瓶加5g无水Na2SO4。
A.e 醚
无水的，乙醇含量不超过0.05%。
A.f β-羟基丁酸钠标准溶液
把0.121gβ-羟基丁酸钠溶于H2O，稀释到100ml〔1mgβ-羟基丁酸钠当量/ml〕。
B 仪器
B.a 气相色谱仪
具在火焰离子检测器。操作条件：用100－120目，载带10%丁二酸二乙二醇酯〔DEGS〕Gas-Chrom Z填充3m×4mm内径的玻璃管。温度〔℃〕：柱温130，注射口200，检测器200；He 80ml/min；H 37ml/min；空气400ml/min；电流计满标灵敏度9×10^-10^A；5mV记录仪；记录纸速度50cm/h。
B.b GC柱
在250ml烧杯中，将1.2g稳定的DEGS溶于100ml丙酮，加10.8g100－200目Gas-Chrom Z到DEGS-丙酮溶液中。在蒸气浴上蒸发丙酮，不时用玻璃棒搅动，放入50－60℃真空炉内完全蒸发1h。用丙酮冲洗GC管，并用真空干燥。用5%二甲基二氯硅烷的甲苯溶液装满管，放置5min。用MeOH冲洗管子直到洗液对石蕊显中性〔约300ml)，真空干燥。用涂好的载体填充管，规定在200℃通入约30ml/min的N2气流48h。可能会接触快速加热柱子的进口部分不要填充。〔任何给定丙基酯的等效分离柱均可使用〕。
B.c 过滤漏斗
约35mm直径的短茎玻璃漏斗。$$ $T表15-1 校正气相色谱的标准溶液$$组合/乳酸钙(b)^a^ mg^b^/乳酸钙(b)^a^ ml/乳酸钙(b)^a^ 标准溶液/琥珀酸(c)^a^ mg/琥珀酸(c)^a^ ml/琥珀酸(c)^a^ 标准溶液$$1/1/2/E/3/2/I$$2/3/2/D/5/2/H$$3/4/2/C/7.5/3/H$$4/5/2/B/10/2/G$$5/6/4/D/15/3/G$$ 6/8/4/C/20/2/F$$7/10/2/A/25/5/G$$8/12.5/5/B/30/3/F$$9/15/3/A/40/4/F$$a.参考试剂下边溶液的字母。$$b.乳酸当量。$T
C 校准
C.a 乳酸和琥珀酸
见表15-1用于校准的标准溶液。对于每一组合按表中列出的体积移取乳酸钙和琥珀酸标准溶液，放入250ml＄24/40圆底烧瓶，在蒸汽浴上蒸发至干，或在100℃旋转蒸发器上更快地蒸干。取出仅够1天用的BF3-PrOH，放入25ml带玻璃塞的锥形瓶。移取2ml BF3-PrOH放入25ml圆底烧瓶，将短茎漏斗(c)插入瓶颈，以蒸气浴上回流10min。$$从蒸气浴中取出，冷却到室温，加4ml饱和(NH4)2SO4，移取1ml AP标准溶液和2ml CHCl3入瓶，振荡混合〔如果GC系统不能用CHCl3，可用醚代替。然而，必须在酯化后24h内用醚进行色谱分离〕。把瓶的内容物倒入30ml分离器，塞好，摇1min，使之分层。放出底层并弃去，把上层转入螺口玻璃瓶，加入约3g无水Na2SO4，用Al箔盖住，用帽密封，简短地摇动。如果在制备以后使用，应存放在冰箱中。$$调节气相色谱仪的灵敏度和衰减，以便不加稀释即适用于标样范围〔对调节好的气相色谱仪，内标(AP)的峰高约为满度的1/3〕，对于标样和样品溶液的校准应使用同样的衰减和灵敏度设置。$$用GC分离溶液时，把注射针头通过Al箔插入。将3±0.2μl清液注入气相色谱仪。平行二次，对每次进样都要测量峰高并计算每种酸的峰高比r，以r值对W做出校正曲线。对于每一种酸，r＝酸性脂的峰高/内标〔AP〕峰高，W＝用PrOH酯化的总酸量mg。$$当溶剂峰拖尾进入乳酸丙酯峰区时，将会延长溶剂峰的尾端，仿佛不存在别的峰一样。用该延长线作为基线测量乳酸丙酯的峰高。
C.b β-羟基丁酸
见表15-1用于校准的标准溶液。对于每一组合按表中列出的体积移取乳酸钙和琥珀酸标准溶液，放入250ml＄24/40圆底烧瓶，在蒸汽浴上蒸发至干，或在100℃旋转蒸发器上更快地蒸干。取出仅够1天用的BF3-PrOH，放入25ml带玻璃塞的锥形瓶。移取2ml BF3-PrOH放入25ml圆底烧瓶，将短茎漏斗(c)插入瓶颈，以蒸气浴上回流10min。$$从蒸气浴中取出，冷却到室温，加4ml饱和(NH4)2SO4，移取1ml AP标准溶液和2ml CHCl3入瓶，振荡混合〔如果GC系统不能用CHCl3，可用醚代替。然而，必须在酯化后24h内用醚进行色谱分离〕。把瓶的内容物倒入30ml分离器，塞好，摇1min，使之分层。放出底层并弃去，把上层转入螺口玻璃瓶，加入约3g无水Na2SO4，用Al箔盖住，用帽密封，简短地摇动。如果在制备以后使用，应存放在冰箱中。$$调节气相色谱仪的灵敏度和衰减，以便不加稀释即适用于标样范围〔对调节好的气相色谱仪，内标(AP)的峰高约为满度的1/3〕，对于标样和样品溶液的校准应使用同样的衰减和灵敏度设置。$$用GC分离溶液时，把注射针头通过Al箔插入。将3±0.2μl清液注入气相色谱仪。平行二次，对每次进样都要测量峰高并计算每种酸的峰高比r，以r值对W做出校正曲线。对于每一种酸，r＝酸性脂的峰高/内标〔AP〕峰高，W＝用PrOH酯化的总酸量mg。$$当溶剂峰拖尾进入乳酸丙酯峰区时，将会延长溶剂峰的尾端，仿佛不存在别的峰一样。用该延长线作为基线测量乳酸丙酯的峰高。
D 测定
