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蛋中的琥珀酸
蛋和蛋制品
- 醚萃取法
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A 仪器
A.a 连续萃取器
见图18-2。
A.b 色谱管
近似为17mm外径×250mm，用棉花或玻璃毛塞在狭窄的末端。
B 试剂
B.a 溶剂
叔-BuOH-CHCl3(1+4)，存放在颗粒状的无水Na2SO4上方。
B.b 甘油指示剂溶液
将75mg3-(4-苯胺-1-萘基偶氮)-2，7-萘二磺酸的NH4盐溶于在蒸气浴上温热的150ml甘油中。
B.c 酚红指示剂
在研钵中，将100mg酚红和5.7ml 0.05N NaOH一起研磨到溶解，然后用H2O稀释到100ml。
C 溶液制备
C.a 液蛋和冻蛋
称200g样品于1L锥形瓶中，加500ml H2O，混匀，避免剧烈振荡；加75ml 1N H2SO4混匀。加125ml 20%钨磷酸溶液，用H2O稀释到1kg，摇动1min。用2张24cm快速波纹滤纸分开过滤，把250ml滤液转入400ml烧杯，蒸发到大约50ml，把另一份250ml加到同一烧杯中，蒸发到10ml。如果体积变少时，物质开始暴沸，则转到蒸气浴上。$$如果200g以下的样品也可用，则取100g样品和一半试剂，用水稀释到500g。用布氏漏斗将沉淀抽滤，尽可能多地收集滤液，把总的已称重的滤液蒸发。
C.b 干蛋
称200g样品于1L锥形瓶中，加500ml H2O，混匀，避免剧烈振荡；加75ml 1N H2SO4混匀。加125ml 20%钨磷酸溶液，用H2O稀释到1kg，摇动1min。用2张24cm快速波纹滤纸分开过滤，把250ml滤液转入400ml烧杯，蒸发到大约50ml，把另一份250ml加到同一烧杯中，蒸发到10ml。如果体积变少时，物质开始暴沸，则转到蒸气浴上。$$如果200g以下的样品也可用，则取100g样品和一半试剂，用水稀释到500g。用布氏漏斗将沉淀抽滤，尽可能多地收集滤液，把总的已称重的滤液蒸发。
D 萃取
E 分配柱的制备
把5g H2SO4〔试剂级“100目”硅酸粉末，色谱用〕放入陶制蒸发器中，加0.5ml新配制的甘油指示剂〔如果已经存放了几周则可能需要更多〕。然后加入最大量的甘油(1+1)使得凝胶固定而不致变粘〔通常为1－3ml〕，再加1滴〔约0.05ml〕约1N NH3·H2O。用研杵研磨成均匀的粉末，加约30ml溶剂制成稀浆，转入垂直固定的色谱管中，在管顶加5－10lb(34.5－68.9kPa)气压，直到溶剂刚好消失进入凝胶顶部，撤去压力，加1ml约含5mg HOAc的CHCl3，再加压到溶剂刚好消失进入凝胶，撤去压力，加5ml溶液，再次加压到溶液消失进入凝胶〔胶体上没有液体时必须撤去压力；胶体干裂则失败。〕
F 测定
向干琥珀酸钠残留物D上加2ml溶剂和3滴H2SO4(1+1)，用玻璃棒搅拌，直到所有颗粒都被润湿〔物质应使刚果红试纸呈酸性〕。以每份0.5g量加入无水Na2SO4直到物质变干〔不是胶状〕，搅拌并倾倒在制备好的分配柱上，慢慢沿柱壁倾倒，以便保持胶体面水平，加压直到溶剂刚好消失进入胶体，再用1ml溶剂洗烧杯，倒到柱上，用搅棒转移烧杯中的残渣入柱，再用1ml溶剂冲洗烧杯，转移上柱，用1ml溶剂洗涤管的内壁，加压直到溶液刚好消失进入胶体，将溶剂填充柱子，加压，使HOAc谱带流出管。当琥珀酸谱带的前部到达管子的收缩部分时，用50ml量筒收集流出液，一直收集到谱带完全从柱中通过，或者直到任一后续谱带的下缘到达管子收缩处的最窄部分以上2－5mm处，而且收集到足够的流出液以确保琥珀酸从柱中洗出。〔把灯放在靠近柱处，但不要近到使柱子受热，以增大谱带的清晰度。〕$$〔在没有后续谱带时，为了确保琥珀酸完全从柱中移出。测定由配好的已知量的琥珀酸钠溶液收集到的流出液的总量。办法是如上所述将游离酸转到柱中，淋洗，等等，滴定25ml，并且继续依次收集多份10ml洗脱液直到中和最后收集部分所需的0.01N碱小于0.2ml为止。所需流出液总量就是测定中收集的数量。〕$$向瓶中加10ml H2O，用0.01N Ba(OH)2滴定，以酚红为指示剂。接近终点时，塞好瓶剧烈摇动，使酸完全从溶剂相中萃出。测定从空白柱流出的等体积流出液进行滴定校正，1ml 0.01N Ba(OH)2溶液＝0.59mg琥珀酸。如果结晶琥珀酸Ba不令人满意，可使用0.01N NaOH溶液进行滴定。
