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冷冻和解冻的去壳牡蛎的检验
鱼和其他海产品
- 圆盘电泳法
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A 原理
冷冻的和解冻溶解的潜在型苹果酸酶〔ME〕活性，与正常溶解型是不同的，可用它们不同的电泳移动率区分开。用于展显凝胶上ME活性位置的介质是由反应混合物中得到的。它被用作光谱法测定被ME还原的烟酰胺-腺嘌呤二核苷磷酸〔NADP〕，和一起的四唑鎓染料和辅助剂。在聚丙烯酰胺凝胶电泳期明显间断的缓冲区和组织化学染色培育期的准确记时是必不可少的。电泳期，凝胶和溶液必须保持低温。测试需要全日的工作，不要用普通制备的凝胶溶液，pH的控制是关键，所有玻璃器皿必须特别仔细地洗净。冲净烘干前，在水中浸煮大于等于6h，最后，用柯达感光溶液(1+200)冲洗玻璃柱，以便去除电泳凝胶。
B 仪器
B.a 制备凝胶柱所需物品
B.a.1 玻璃柱
62mm长×5mm内径软玻璃管，两端未抛光。
B.a.2 一次性注射器
5ml，无针头、内径0.76mm、外径1.22mm聚丙烯管，装凝胶用〔注射器可清洗再用〕。
B.a.3 水层点样器
2ml注射器，无柱塞、用25号规格的皮下注射针头，将其稍稍弯曲，以便 于应用。
B.a.4 一次性注射器
2.5ml，带针头，为洗去未凝聚的凝胶溶液用。
B.a.5 清除工具
磨去凸缘的1ml玻璃注射器、无柱塞，一头接22号规格皮下注射针头，另一头接短橡胶管，短橡胶管的另一头接出水龙头连接器，每段橡胶管间附加1/2塑料管接头，以便于清除工具各部分的连接。
B.b 凝胶光聚合仪
光聚粗孔凝胶的简易设备为开口的，具有一底板可移动的木盒。底板上粘有成行的小橡胶底帽〔用这些提供的仪器或为排列盘底的橡胶垫可自官方供应机构得到〕，盒的顶盖下安装荧光灯，灯的位置为：当底板放入时，橡胶帽行列直接在灯下；玻璃柱座入橡胶帽后，距光约2.5cm。
B.c 电泳仪
装配能提供0－50mA恒定电流的稳压电源的圆盘电泳槽。
C 电泳试剂的制备
C.a 分离凝胶
〔小孔、化学聚合的〕
C.a.1 溶液A
溶液A-1、A-2等体积混合制成。
C.a.2 溶液A-1
91.5g三羟甲基氨基甲烷、0.575ml TEMED〔N，N，N'，N'-四甲撑二胺〕和约116ml 1N HCl混合到pH9.0，用水稀释到250ml。
C.a.3 溶液A-2
用水溶解70g丙烯酰胺和1.8375g N，N'-甲撑双丙烯酰胺〔BIS〕于水中并稀释到250ml。
C.a.4 溶液B
0.14%过硫酸铵水溶液〔注意：丙烯酰胺单体属神经性毒物，操作时须戴防渗透手套，不可用嘴吸移液管。当干燥、触摸试剂时，必须在有效的通风橱内进行，与该物质接触过的人，要严格体检。〕$$溶液A-1和A-2用棕色瓶贮存在冰箱里，可稳定约6个月。溶液A和B，在冰箱中只能保存一周。只能在使用前，再用等体积的A和B配制，制备分离凝胶体。
C.b 浓缩和样品胶
〔大孔、光聚合的〕
C.b.1 溶液C
由溶液C-1,C-2和C-3(1+2+1)混合配制，
C.b.2 溶液C-1
混合14.95g三羟甲基氨基甲烷、1.15ml TEMED和约120ml HCl到pH5.1，再用水稀释到250ml。
C.b.3 溶液C-2
以水溶解50.0g丙烯酰胺和12.5g BIS并稀释至500ml。
C.b.4 溶液C-3
4.0mg维生素B2溶于100ml水中。
C.b.5 溶液D
40%(w/v)蔗糖水溶液。$$所有溶液均用棕色瓶贮存在冰箱里，可稳定约6个月。浓缩胶，用前1h内，以等体积混合溶液C和D制得，室温，避光保存。样品胶体，用离心分离得到的组织液0.04ml与1ml浓缩胶在使用前混合制得。
C.c 电极缓冲液〔10X〕
用水溶解57.6g甘氨酸和12g三羟甲基氨基甲烷并稀释至2L。每次用前，以水1+9稀释，pH应为8.3。阳极缓冲液内加几滴约1%溴苯酚兰水溶液，使其显亮兰色。每次操作后，阴极、阳极缓冲液均弃之。
D 组织化学试剂的制备
培育12根柱所需混合物的制备：将20mg NADP〔烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸磷酸，ICN-药物〕，15.0ml 0.144M三羟甲基氨基甲烷缓冲液〔17.44g/L、冰箱贮存、pH8〕，9ml 0.095M苹果酸钾〔127mgL-苹果酸以KOH中和稀释至10ml〕，2.4ml 0.06M KCN〔在通风橱内，用水溶解0.40g KCN，再以1N HCl调至pH8〔约6ml〕并稀释至100ml，于具玻塞锥形瓶内冷藏〔为隔断对呼吸链的电子流出〕与约1g聚乙烯吡咯烷酮〔助溶染料〕一起混合。混合物可提前几个小时制备，贮备在冰箱里。如认为需要，也可以水代替苹果酸钾作控制介质。$$制备甲硫酸吩嗪水溶液〔2.4mg/ml水)，该溶液在冰箱里避光保存可稳定几个星期。$$使用前1h内，配制15.4mg氯化对硝基蓝四唑(NBT.Cl)在7.0ml、0.144M的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的溶液(1.74g/100ml)〔如用控制介质，用量加倍〕。$$凝胶培育前，立即向主体溶液加0.4ml甲硫酸吩嗪溶液和7ml NTB.Cl溶液。
E 离心组织液的制备
在20.000g低温离心机内，离心4－5个整牡蛎肉20min〔绝不可用绞碎或混匀的样品，因机械对组织的破坏，其结果与冷冻的相似〕，用一次性注射器抽净上层清液〔CTF〕，冷藏直至准备制备样品凝胶。运载在分装分离凝胶前应于清晨即离心分离，以便为准备CTF留有充裕的时间。
F 电泳法
F.a 凝胶柱的制备
从冰箱里取出制备凝胶的溶液，加热到10－15℃勿须升至室温，但溶液越冷，溶液聚合越慢。将玻璃管垂直座在光聚盒底板上的小橡胶帽上〔注意：防止眼睛受紫外线直射〕。如实验须用12根柱，制备14－15根，以便替换任何有缺陷的柱子。缓慢、连续地向小烧杯注入等体积的溶液A和过硫酸铵，并使之轻缓旋摇〔每10ml足够装16根柱〕。避免混合物中带进气泡，该分离凝胶混合后约45min聚合。$$用5ml一次性的注射器，缓缓抽出分离凝胶溶液。擦净注射器顶端，插入7.5－10cm长的小聚丙烯管，通过管道，推动凝胶溶液，赶出一切气泡，然后填充柱子，使溶液表面与顶端距离小于15mm。如需要，再装注射器和重复装。$$当分离凝胶装入所有柱时，它们必须呈水层样。既能防止胶体与空气接触，又要确保其与随后加入的浓缩胶体间有平整的内表面。在小烧杯的水里，滴入0.1%的溴酚兰示踪剂水溶液，使水呈淡兰色。加约2ml该液到2ml注射器(a)(3)里。小心形成水层，甚至小小水滴落下也能激烈扰坏〔“炸弹”〕胶体，被冲击的胶体必须弃之。用一只手稳定住柱，另一只手握住呈水层注射器。擦拭针尖〔用手指稳定柱子最简单〕，当它进入柱时，保持液滴形成的大小。迅速放入针头并沿着柱内壁缓缓注入，使水迅速滑到胶体表面。如果胶体被冲击了，用一次性注射器(a)(4)取出搅坏的凝胶，重新用分离凝胶混合物装柱。$$在呈水层完成时，用定时器设置40min的聚合期，此时，混合浓缩凝胶体溶液。小心地向小烧杯注入等体积的溶液C和40%蔗糖溶液，配制的量须考虑到浓缩凝胶需5或6ml及每个样品胶需2ml。旋摇混合物，室温下避光保存。$$分离凝胶体聚合完成后，颠倒柱子，缓缓倾出水层，用棉花擦净倒出时的一切剩余液滴，要小心，不要扰动胶体表面或玻璃上留下纤维。再直立柱子，用另一个5ml一次性注射器接上短的聚丙烯管，向每根柱内加少量浓缩凝胶以洗去最后的水，用一次性注射器(a)(4)移出洗涤的混合物。第每根柱加浓缩凝胶，在分离凝胶体表面上形成6mm的层，如前，加入水层。$$置柱于盒内距荧光灯7.5－10cm以内，开灯，让凝胶静立10min，然后，再于灯的直射下10min，灯应距柱顶约2.5cm。在此期间，从离心机中取出CTF并冷藏。$$浓缩凝胶光聚合时间到后，闭灯。如前，从柱内除去水层，并制备样品胶。在5ml烧杯里，以每个样品0.08ml CTF加进盛有2ml浓缩凝胶的5ml烧杯中或按此比例，配成任何所需的量，混合均匀，按浓缩凝胶的步骤，先冲洗，然后再加入6mm厚的样品胶到柱中〔用另外的5ml一次性注射器和管道〕，加水层，如浓缩凝胶那样进行光聚合。
F.b 分离
在低温室安装电泳并在使用前冷却电极缓冲液〔或将槽放在冰箱里或放在蛇形管内循环冰水的致冷池里〕。在致冷期间，制备电泳时用的组织化学介质，保存四唑鎓染料和助染剂直到胶体培育之前；所有溶液须冷藏保存，直至使用。$$一旦样品胶聚合，即在低温室安装电泳。柱顶部装有样品胶的柱子放进上槽容器，对着阴极〔注意：当盒打开时，电泳盒的盖应有开关切断通向电极的电流，防止接线和电极对物体的接触〕，向下〔阳极〕槽加入1L稀释的电极缓冲液，在带有缓冲液柱子的突缘末端，放置〔阴极〕槽〔从柱延伸〕放到下槽的上部之前，滴加溴酚蓝的浅蓝色的稀电极加1L缓冲液向上槽中先吸取少量到柱的顶部，以避免产生气泡，溴苯酚兰比蛋白质移动快，它将通过并超越蛋白质，形成一个可见的移动前沿。$$电泳操作期间，用恒电流不要停止电泳。最初0.5h定电流1mA/柱，后2h以2mA/柱，直至示踪染料离柱。
G 凝胶的培养
G.a 取下凝胶柱
当电泳完毕后，从槽中取下玻璃柱，弃去缓冲液，由玻璃柱内取出凝胶。在清除工具的橡胶管上接好合适的龙头连接器上注入稳定的水流，用针头缓慢地将凝胶从玻璃柱中取出。先松动胶体柱的阳极端，再松动阴极端。在水压下，凝胶很容易滑出。废弃样品和浓缩凝胶。分离凝胶放进10×75mm的试管，阴极端向上。
G.b 凝胶染色
立即加组织化学试剂，塞住试管，颠倒几次，室温下置于暗处25－30min〔但不大于30min〕。随即用自来水漂洗凝胶，然后贮存在水里，勿须复染色。
H 说明
因凝胶上的甲潜会随时间扩散，可用光密度计或波拉罗依德(Polaroid)相机留下永久性记录。未冷冻的牡蛎大多显示单频带，常常模糊或看不见；冷冻的或解冻的牡蛎，在相同位置产生宽频带，有或无、一至二条附加带和一条窄阴极带。$$冷冻及解冻的可疑批牡蛎，对照原始样品检验。如图形相同，则这批可疑的牡蛎块是冷冻或解冻的；如图形不同，则不是。
