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海味中的组胺
鱼和其他海产品
- 化学方法
- 〔使用经玻璃容器重蒸的蒸馏水制备试剂和测定，不用肥皂洗玻璃器皿，用新鲜的铬酸洗液。用自来水冲净，然后用蒸馏水洗三遍，也可用乙醇浸泡或洗涤玻璃器皿〕。
A 试剂
A.a 苯-正丁醇混合物
(3+2)(v/v)。
A.b 酸式琥珀酸盐棉
在500ml锥型瓶里装300ml HOAc，溶解5g用前刚熔融的无水NaOAc和40g琥珀酸酐，将10g脱脂棉撕成条浸在溶液中；接上含干燥剂的干燥管，100℃加热48h〔烧瓶浸置蒸汽浴中使浸到颈部〕。过滤，用水、HCl(1+9)、水，最后用乙醇充分洗涤，在100℃真空干燥箱里干燥。
A.c 重氮化试剂
用0.1N HCl溶解0.1g，在热水中重结晶的对硝基苯胺，并稀释到100ml，于冰箱中贮存。用水溶解4g NaNO2并稀释到100ml，冰箱中贮存。临用前，置10ml对硝基苯胺溶液于冰浴内5min，再加1ml NaNO2溶液，混匀。同前在冰浴里静置大于等于5min。
A.d 偶合缓冲液
溶解7.15g偏硼酸钠(NaBO2)和5.7g Na2CO3于水中并稀释到100ml，贮存在聚乙烯瓶中。
A.e 巴比妥缓冲液
溶解10g巴比妥纳于1L水中，用pH计，以HOAc(1+15)〔约25－30ml〕调节至pH7.7，贮存在冰箱中以防霉菌生长。用时加热，以溶解一切沉淀〔50－250ml缓冲液瓶可于室温下保存，一旦霉菌生长，弃之，重新取用大瓶中的溶液〕。
A.f 组胺标准溶液
组胺盐酸盐〔USP参比标准〕于硫酸干燥器中干燥2h，溶解0.1656g干燥的组胺盐酸盐在水中，并稀释至100ml(1ml＝1mg组胺盐酸盐〕。用水稀释10ml该贮备液成100ml〔1ml＝100μg组胺〕；用水稀释5ml该稀释的标准液和5ml甲醇成100ml(1ml＝5μg组胺盐酸盐)。冷处贮藏，每周制备新的标准液。
A.g 4-甲基-2-戊酮〔甲基异丁基酮〕
化学纯。回收用过的酮，用饱和NaHCO3溶液洗一遍，用水洗三遍，蒸馏，保留沸点在115－118℃的馏分，在475nm处校对A值。
A.h 苯甲醛
无氯的。
A.I 稀硫酸
0.40±0.02N，准确标定。
B CAS柱的制备
用酸式琥珀盐棉〔CAS〕小团〔约50g〕紧紧填充在柱内制成。该柱是用15ml离心试管切割或爆裂除掉底部而得。用3份15ml水、2份3ml乙醇洗涤棉塞子，让溶液通过CAS滴下，每次溶液的最后部分，用针头穿过橡胶塞的10ml注射器，吹出柱外，每次用后，CAS棉塞立即用水和乙醇如上述程序洗涤。CAS塞可反复用数月，洗后用烧杯倒扣在柱上，防止落灰。
C 测定
转移10g制得的样品，17-27C，到半微量高速捣碎机中，加约50ml甲醇，捣碎约2min。转移到100ml具玻璃塞容量瓶中，用甲醇冲洗捣碎机缸及盖，洗液倒入容量瓶。在水浴加热到60℃，保持15min，冷却至25℃，用甲醇稀释到体积，经折叠滤纸过滤。醇的滤液可在冰箱内贮存数星期〔贮存时析出的细末沉淀可忽略〕。$$5ml滤液用水稀释到100ml〔不管是否混浊〕，吸5ml试样于16×150mm具玻塞试管，加1滴苯甲醛〔脱氯〕和0.2ml 20%的NaOH〔加碱后pH应约为12.4－12.5〕，用力振摇约25次，静置2min并加5ml苯-丁醇混合液，用力振摇约25次，静置5min待分层。如形成乳化，离心分离。$$用带有橡胶球的细尖管转移上层清液到预先制备好的CAS柱，避免带入任何水相。用5ml苯-丁醇混合液再萃取水相，如前法振摇，静置5min，转移上层清液到柱中。用洗瓶中醇的细流冲洗柱顶和壁，洗涤液流出CAS，用3ml乙醇洗柱，洗涤液流出；用2份3ml水洗柱，洗涤液流出。废弃溶液和洗液。$$用2.0ml、0.4±0.02N H2SO4〔酸的体积和浓度都应精确〕，从CAS中洗脱组胺，使酸沿管壁而下进入25ml玻塞锥型瓶中，接着用3ml水洗涤，滴水停止后，洗涤液流出。$$在冰浴上冷却洗脱液，需铅环或夹子以免倾斜，称量烧瓶，使其静置5－10min，加0.5ml冷却的重氮化试剂，并使其在冰浴上静置5min。加入0.5ml偶合缓冲液，〔体积要精确，用Ostwald移液管最好〕连续旋摇或振摇以免局部碱化〔偶合缓冲液加后，pH5－6〕。使其在冰浴上静置5min，用约0.25g粉末Na2B4O7·10H2O分次加入以饱和溶液，立即振摇溶液并持续约30s以确保溶液迅速、完全地饱和〔最后约pH8.6〕，在冰浴里静置约15min。$$吸入5.0ml甲基异丁基酮，剧烈振摇25次，立即全部倒入16×150mm试管〔不用洗〕，在室温下静置10min待分离、升温。用细尖的滴管移出上层清液到第二个16×150mm、含5ml巴比妥缓冲液的玻塞试管中，避免带入含水相和固体〔如果存在的话〕〔移出液不需定量〕，剧烈振摇约25次〔洗后的巴比妥缓冲液约pH8.3－8.4〕，静置10min，待分层。$$用细尖滴管移出上层清液，于1cm比色池内，在475nm处以甲基异丁基酮为参比测定A值，重复测定样品产生的A值大于25μg标样，该样由1ml甲醇滤液用水稀释至100ml制成，也可将水稀释液用水稀释成1+4〔或更多些〕来代替。$$标样和空白测定如下：吸取5ml、5μg/ml组胺标准溶液于16×150mm玻塞试管中，吸取5ml 5%甲醇于同样试管作空白。按测定中第二段、第二行开始进行。$$从标样A(A')和样品〔A〕中减去空白的A，计算样品中的组胺：$$ μg 组胺＝△A×25/△A'
