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鱼种类的鉴定
鱼和其他海产品
- 丙烯酰胺圆盘电泳法
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A 仪器
A.a 圆盘电泳仪
组装仪器如图17-3所示。组成单元有：可调电源(60mA、500V、DC)；两个直径13cm的塑料贮水槽；碳或铂电极；管的密封垫〔标准电绝缘垫片〕；65×5mm内径玻璃管。“顶视图”代表上面的贮水槽的底部，有排列的橡胶密封垫孔，凝胶管从上贮水槽 的底部伸出，并浸入下贮水槽的缓冲液中〔6，12，1200，1200L符合要求〕。$$聚丙烯酰胺凝胶柱由3层组成：上层、大孔〔堆积〕凝胶，含样品离子，在其中，离子电泳的浓度是开始的浓度；中层，大孔凝胶〔或层胶〕，在其中，样品离子电泳的浓度是完成的浓度；下层，小孔凝胶，在其中，进行电泳分离。$$每次测定后，充分清洗仪器，先洗样品试管并浸在铬酸洗液里，然后用水充分冲净。当仪器不用时，将上、下贮水槽中的缓冲液倒出，B(b)(7)，分别置于容器内，于冰箱内保存。上槽的缓冲液，通常可做6次测定，当pH下降到8.2，弃之。
A.b 光聚合灯
15W荧光灯。
B 试剂
B.a 相对稳定的
丙烯酰胺单体，N，N'-甲基-烯-双丙烯酰胺(Bis)，2-氨基-2羟甲基-1，3-丙二醇(Tris)，N，N，N'，N'-丁二胺(TEMED)，过硫酸铵，甘氨酸〔无NH3〕，苯胺黑。
B.b 相对不稳定的〔溶液〕
稳定约6个月，冷藏溶液1－6。
B.b.1
48ml 1N HCl、36.3gTris、0.23ml TEMED，加水至100ml(pH8.8－9.0)；
B.b.2
25.6ml 1M H3PO4、5.7gTris、0.46ml TEMED，加水至100ml(pH6.6－6.9)；
B.b.3
30.0g丙烯酰胺、0.8g Bis，加水至100ml；
B.b.4
10.0g丙烯酰胺、2.5g Bis、加水至100ml；
B.b.5
4.0mg核黄素，加水至100ml；
B.b.6 催化剂
0.14g(NH4)2S2O8，加水至100ml〔每周新配〕；
B.b.7 缓冲液
3.0g Tris，14.4g甘氨酸，加水至1L(pH8.8－9.0)；
B.b.8 样本染色剂
1.0g苯胺黑，加7.5%(v/v)醋酸至200ml；
B.b.9 示踪染料
0.005%溴苯酚蓝水溶液。
B.c 工作溶液
每次测定需新配。
B.c.1 下层胶〔分离胶〕
混合溶液(b)(1)、(3)和水(1+2+1)，pH8.8－9.0，将其与催化剂溶液〔6〕混合(1+1)，形成凝胶。
B.c.2 上层胶〔堆积胶〕
混合溶液(b)(2)、(4)和〔5〕(1+2+1)，pH6.6－6.8，暴露于荧光灯下，如17-5B(b)，形成凝胶。
C 柱的制备
C.a 下层和浓缩凝胶
盖住玻璃管底部并置于管架中，在20ml注射器内混匀带催化剂的(c)(1)，加入管内至距管顶约12mm以制备分离凝胶。充填期间，不断轻敲管壁，以免气泡在凝胶面下产生。在20ml水中滴几滴示踪染料，用眼药滴管，小心地沿着管壁加液使在分离胶体顶部形成6mm的染料溶液，而不要扰动胶体表面〔染色剂溶液有助于区分水和胶体层〕，废弃个别边界线不明显的试管，让胶体聚合30min〔聚合时间基于在24℃的反应，用前让冷藏的试剂在室温下静置约20min〕。缓慢摇抖出水层，加入浓缩胶溶液(c)(2)约0.1ml至柱顶部〔其功能是“浓缩胶层”〕。在胶体顶部，小心复盖3mm厚的水层。在胶柱架前约7－13cm处放置光聚合灯，使浓缩胶聚合10－15min，当浓缩胶由浅绿色变为半透明的白色时，光聚合完成，摇抖出顶部水层。
C.b 样品凝胶
D 测定
倒约500ml缓冲液(b)(7)〔含足够的示踪染色溶液，以产生明显的蓝色〕于下槽中，或使液面盖过下面 的电极6mm以上，将柱〔顶部〕的样品端插进上槽底部的橡胶孔内，使玻璃管顶部与橡胶圈顶部齐平。用塞子塞上不用的孔，以免上面缓冲液漏出。将上槽座落在下槽上。$$慢慢倒约250ml缓冲液〔含示踪染料〕，至上槽的中部，注入要慢，避免样品交叉污染。慢慢地用注射器向每一样品管导入缓冲液，特别小心地将样品胶和缓冲液之间的空气全部释放使电流通过。接好电极极性，使样品离心向下槽迁移〔正极〕。接通电流，调节电源得到5mA/样品管〔5mA×样品柱数＝电源调节的总mA数〕电流。当“前沿”带达到样品柱底部5mm以内时〔约30－40min〕，关闭电流。$$转移胶体柱〔先从“样品端”或“顶端”〕到试管中，管内装有2/3被水(1+1)稀释的样品染色液，电泳后，立即染色并固定。如没有适当地染色和固定，凝胶中的蛋白质将扩散。将管放在盘的水面下，取出凝胶柱。用冷水注满10或20ml注射器，将凝胶移动针头从柱的样品端凝胶与玻璃之间插入，使针尖到达分离凝胶。保持针头水平贴着玻璃表面，以免擦伤胶体，围绕凝胶周围转动针头。拔出针头并从另一端插入约1cm深，握住针头，使其贴着玻璃柱内表面，同时，用力从针头压出水流。如这此操作进行得很小心，完整的、未受损的凝胶可自由脱落，并能滑出管子。如需要，可用橡胶球的少量气压帮助排出胶柱。$$当凝胶被染色的同时，如下法制备75×7mm〔内径〕玻璃褪色管：将经火抛光的管端放在大直径底盖上，加约1cm带有催化剂的分离凝胶到柱底，使之聚合。染色完成时〔约15min〕，将试管上沿对着烧杯内壁，缓缓倒出染色液，留凝胶于管内。用7.5%乙酸(v/v)漂洗胶体两次，除去残留的染料，先将凝胶底部“前沿”转移入褪色管，该管中凝胶底塞已取掉，盖被移走。$$褪色管放在上槽底面上的橡胶孔内，塞住所有不用的空孔，加入约500ml 7.5%的醋酸到下槽中，加约250ml到上槽内。如先，用装有7.5%醋酸的注射器保证驱除凝胶和醋酸之间的所有空气泡。通电并调节电流到5mA/柱(5mA×柱数＝总mA〕，凝胶在约45－60min褪色。当不含蛋白质的凝胶部分被明显染色或有浅兰色，取出样品管并放入含7.5%醋酸的小试管中，以观察和保存。用目测比较已完成的管和同样操作的可靠的样品和标样制备的模式。
