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煮熟和冰冻蟹肉的一般鉴定
鱼和其他海产品
- 薄层聚丙烯酰胺凝胶等电位聚焦法
- 〔注意：吸入，摄入或吸收丙烯酰胺可引起神经系统紊乱，在制备和处理凝胶时，戴上一次性手套。〕
A 原理
尿素萃取的蛋白质受薄层聚丙烯酰胺凝胶等电位聚焦所产生的pH梯度作用展开，样品带形与那些已知种属的带形比较。
B 仪器
B.a 薄层等电位聚焦仪〔TLIEF〕
MRAM-150型。
B.b 恒温循环器
任何可保持0－10℃的。
B.c 电源
恒功率型，能维持恒功率1W最低到500V。
C 试剂
C.a 阳极溶液
0.1%(v/v)，pH7－9的两性电解质，冰箱中贮存。
C.b 阴极溶液
1.0%(v/v)，pH9－11的两性电解质，冰箱中贮存。
C.c 两性电解质
混合2份pH7－9〔干物含量40%〕的两性电解质与1份pH3.5－10〔干含量40%〕，冰箱中贮存。
C.d 尿素
10M，超纯，每天新配。
C.e 过硫酸铵溶液
10%，每周新配。
C.f 聚丙烯酰胺混合液
溶20g丙烯酰胺和0.8g N，N'-甲叉-双-丙烯酰胺于水中并稀释到100ml，冰箱中贮存。
C.g 染色剂Ⅰ
0.1%无水CuSO4和0.5%考马斯亮蓝R-250醋酸-乙醇-水(10+30+60)溶液。
C.h 染色剂Ⅱ
0.1%考马斯亮蓝R-250醋酸-乙醇-水(10+25+65)溶液。
C.I 褪色剂
醋酸-乙醇-水(10+10+80)。
D 样品的制备
用机械捣碎机将融化的蟹肉与等体积的10M尿素〔蟹 肉g的数值与尿素的ml数值相等〕的混合物捣混2min，或用手摇组织研磨器混合，充分研磨至融蜡状。捣碎机捣混的样品染色后，产生的色带颜色较黑。以3000×13000×g离心，吸出上层清液，冷藏供当天使用。
E 凝胶的制备
根据两性电解质制备的说明，用1mm间障条制备胶体模，当天制备。250×110×1mm的凝胶，按下顺序将试剂加入烧瓶中：16.4ml 10M超纯尿素、6.0ml 50%甘油、10.0ml聚丙烯酰胺混合物和2.4ml两性电解质溶液。真空下脱气3min，加100μl 10%的过硫酸铵再脱气1min，用巴斯德移液管迅速转移凝胶到模具中。凝胶聚合后〔约30min〕，冷冻模具大于等于15min。小心取出模板和间隔板，留下粘在玻璃板上的凝胶，将玻璃板置于复盖一层轻质石蜡油的冷却平台上。
F 测定
用阳极电解质溶液充分润湿电极条〔TLIEF制品〕，于阳极凝胶表面，用阴极电解质溶液湿润第二根电极条，于阴极凝胶上，将这些纸条放在凝胶边沿〔中心对中心〕，相距约90mm排列，这样，嵌进盖板的铂电极就会搁在电极条上提供电流。放置5×10mm Whatman 3MM 纸条靠近阳极条，但不接触，吸取20μl蟹肉萃取液滴于每个样品条上，每两 个纸条用20μl萃取液，彼此顶压顶重合放置，使染色后得到较深黑色的蛋白质色带，冷却平台到0－10℃，连续聚焦仪电源。观察正确极性。提供W的恒功率。升高至最大500V恒电压下，连续聚焦约20h。$$关闭电源，从冷却板上取出凝胶，清除板上石蜡油，围绕玻璃板和电极条放置有弹性的带子，室温下，染色蛋白质。方法如下：染色剂Ⅰ，4h；染色剂Ⅱ，4h；褪色剂，1h。褪色后，立即检定未知样品并与已知萃取物的带形比较。
