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粗蔗糖中的葡聚糖
糖及糖产品
- Roberts铜测定法
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A 原理
所有高分子量〔大于10，000道尔顿〕物质经80%的乙醇沉淀与糖分离。沉淀物经过滤，洗涤后重新溶解于水中。将碱性Cu〔Ⅱ〕试剂加入到此液中可从粗蔗糖中的其它高分子量物质中选择性地沉淀出葡聚糖。滤出该沉淀，其中的葡聚糖用比色法进行测定，其原理是酚-H2SO4试剂将葡聚糖络合物分解为单体葡萄糖分子，并发生显色反应，其强度正比于样品中葡聚糖的总量。样品及反应混合物应保持不受其它糖分，含碳水化合物成分杂质及对酚-H2SO4试剂有显色反应成分的污染。
B 仪器
B.a 比色计或分光光度计
在485nm测吸光度值A或透光率T。
B.b 玻璃砂漏斗
粗号，孔径号C，15ml。
B.c 奈氏管
35ml，或平底试管，短到能置于抽滤瓶中。
C 试剂
无特殊声明时使用试剂级化学试剂。水为蒸馏水或去离子水。
C.a 无水乙醇
使用无水乙醇，不要使用95%乙醇。
C.b 80%乙醇
80ml无水乙醇中加20ml水。
C.c 助滤剂
分析级，经酸洗处理过。
C.d NaOH试剂溶液
2.5N的NaOH，Na2SO4饱和。将100g NaOH溶解于水中，并稀释至1L。加无水或含结晶水的Na2SO4到有一些结晶不溶解为止。用非玻璃材料的塞子塞住后保存于试剂瓶中。试剂溶液可保存1个月。
C.e Cu贮备液
将3.0gCuSO4·5H2O溶解于50ml的水中。将30.0g柠檬酸钠溶解于50ml水中。将这两种溶液混合后用水稀释至1L。溶液可保存2周。
C.f Cu试剂溶液
用50ml水稀释50ml铜贮备液。将12.5g无水Na2SO4溶解于此液中。试剂应在使用的当天配制，不能保存。
C.g 洗涤液
向50ml水中加入10ml Cu试剂溶液及10ml 2.5N的NaOH试剂溶液。
C.h 5%的酚溶液
将5g纯的苯酚溶解于水中，并稀释到100ml。溶液可保存2周。
C.i 葡聚糖
分子量范围不限。
C.j 2N H2SO4溶液
将98g硫酸溶于水中，并稀释到1L。溶液可保存1个月。
D 标准曲线的制做
对用于做标准曲线的葡聚糖应测其水分的含量，并加以校正。在称量瓶中称量500mg标准葡聚糖，并于105℃下干燥4h。在无水CaCl2保干器中冷却。称量并按下式计算水分的含量：$$水分%＝[〔原样品重量－干样品重量〕/原样品重量]×100$$称量500mg葡聚糖〔校正水分后的重量〕，将其溶解于水中，再稀释至500ml。不要使用预先干燥的葡聚糖，因为它不易溶解。葡聚糖溶液的浓度为1mg/ml。对每一条标准曲线的测定应新配溶液。$$将100ml 1.0mg葡聚糖/ml的标准溶液稀释到1L(0.1mg葡聚糖/ml)，取该液10，20，30，40，50，60，70，80，90和100ml，分别稀释到100ml来制做标准曲线。每个溶液中葡聚糖的含量分别为0.01,0.02,0.03,0.04,0.05,0.06,0.07,0.08,0.09和0.1mg/ml。$$以吸光度A或透光率T为纵坐标，葡聚糖的浓度(mg/ml)为横坐标做标准曲线。
E 酚-H2SO4试验
向10支20×150mm的试管中分别加2.0ml上述10种浓度的葡聚糖标准溶液。向第11个管中加2ml水作为空白。每个管中加1ml 5%的酚溶液。轻缓地摇动试管使酚与糖溶液混匀。$$向每支管中加10ml浓H2SO4，最好使用塑料的自动取滤器。迅速放入酸以保证溶液能充分混合。不要让取液器接触液面，或让酸处于溶液的表面。在一个漩涡式混合器上使溶液充分混匀。$$将一排试管放入沸水浴中2min，然后冷却30min。$$以空白做参比在比色计或分光光度计上于485nm处读吸光度A或透光率T〔最好读A〕。将空白的A值调到零，然后读样品的A值，空白和试样应使用相同比色池或相匹配的池子。平行测2次计算平均值。$$为了保证测定的精确度，A值应在0.1－0.6(T>25%)之间。若A大于0.6，则应稀释后再测定。该步骤对做标准曲线时不必要，但对糖样品可能是需要的。为了制备稀溶液，从上述取2.0ml进行酚-H2SO4试验的溶液〔样品糖测定最后是25ml〕中，移取5ml到25ml容量瓶中，用水稀释至25ml。在酚-H2SO4试验中取2ml该稀释液。在最终计算葡聚糖的ppm数时应考虑一个稀释系数5。
F 测定
准确称量40.0g糖到烧杯中，用少量的水溶解后定量转移至100ml容量瓶，并稀释至刻度。用定性滤纸经漏斗过滤大于等于50ml的溶液以除去粗的悬浮物。$$移取10ml滤液到100ml的烧杯中，加0.3－0.4g分析级助滤剂，搅拌；加40ml无水乙醇再搅拌。静置5min使形成沉淀。用玻璃砂漏斗和真空抽滤器滤出沉淀。$$用80%的乙醇洗涤沉淀5次，每次用乙醇充满漏斗，让乙醇通过沉淀吸下去。不要使沉淀吸干，也不要使乙醇溢出漏斗。这一步骤对于消除仍吸附在沉淀上的糖对酚-H2SO4试验的干扰至关重要。$$最后一次加的乙醇吸干，然后将沉淀及助滤剂定量地转移至25ml容量瓶。使用尽可能小的量的水转移。首先，置一个50或60mm的长颈漏斗于空的容量瓶上，将有沉淀的玻璃砂漏斗倒置于漏斗之上，向玻璃砂漏斗的颈中加水，用空气软管将沉淀及助滤剂吹入长颈漏斗，用洗瓶将残留物向长颈漏斗中洗两次。将沉淀用刮勺弄散后洗入25ml容量瓶，再用水调至刻度。$$将带槽纹的Whatman42号，110mm滤纸放入一个60或80mm的漏斗，过滤上述溶液。收集10ml以上的滤液用于分析。$$移取10ml滤液于20×100mm的玻璃或塑料试管中，加2ml 2.5N的NaOH试剂溶液，2ml Cu试剂溶液及0.2g分析级助滤剂。然后将试管〔排在一排〕放入沸水浴中5min以便将Cu-葡聚糖络合物沉淀于助滤剂上。冷却20min。$$用玻璃砂漏斗〔粗孔径，5ml〕过滤含络合物沉淀。用洗液淋洗试管两次，每次10ml，洗完的溶液加到玻璃砂漏斗中。弃去滤液。$$将带有沉淀的玻璃砂漏斗安放在装有短萘氏管(35ml)〔或平底容器〕的真空瓶上。将玻璃砂漏斗的颈伸入到奈氏管中。向玻璃砂漏斗中的沉淀上加2ml 2N的H2SO4溶液；打开抽气系统，将酸液抽过沉淀，重复一次上面的步骤，然后用2ml水淋洗沉淀。$$将含可溶性葡聚糖的滤液定量转移至25ml容量瓶，并用水稀释至刻度。$$移取2ml上述溶液到20×150mm的试管中，按酚-H2SO4试验步骤进行实验。
G 计算
由标准曲线读出葡聚糖浓度，mg/ml。$$样品中葡聚糖(ppm)＝[〔由标准曲线得葡聚糖浓度，mg/ml〕×〔Cu-葡聚糖络合物溶液最终体积ml数〕×〔醇沉淀溶液的ml数〕×10^5^]/[〔用于Cu沉淀溶液的ml数〕×〔用于醇沉淀的溶液的ml数〕×〔稀释到100ml的固体样品的重量〕]。$$若A＝稀释到100ml的固体样品重量(g)；B＝用于醇沉淀溶液(ml)；C＝醇沉淀溶液(ml)；D＝用于Cu沉淀的溶液(ml)；E＝Cu-葡聚糖络合物的最终溶液(ml)；F＝葡聚糖〔由标准曲线所得〕，(mg/ml)则：$$葡聚糖，ppm＝〔F〕×〔E〕×(C/D)×(1/B)×(1/A)×10^5^$$所以，在上述步骤中：A＝40，B＝10，C＝25，D＝10，E＝25。
