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蔓越桔混合果汁和苹果汁中的奎尼酸、苹果酸和柠檬酸
水果及水果制品
- 液相色谱法
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A 原理
果汁经一次性柱洗脱，以去除干扰物，过滤，注入液相色谱系统。使用串联的2个反相液相色谱柱，应用紫外分光光度检测器，在214nm下，将奎尼酸、苹果酸和柠檬酸进行分离。采用外标法比较定量。
B 仪器与试剂
B.a 液相色谱仪
配有U6K型进样器，450型可调波长检测器，选用214nm、0.1AUFS和积分记录仪。
B.b 分析柱
B.b.1
25cm×4.6mm Supelcosil LC-18柱或其他相当的柱子，填料粒度5μm，于后串联
B.b.2
10cm长的Radial－Pak C18柱，填料粒度5μm，10cm长使用Radial Compression Module.Radial－Pak C18柱可以用任何标准的25或30cm内装10μm粒度填料的反相C18不锈钢柱代替。在柱〔1〕前连接Bio-Rad反相微型保护柱(ODS-10)。流动相：磷酸盐缓冲溶液，流速0.8ml/min。灵敏度0.1AUFS。
B.c 一次性处理柱
Sep-Pak C18柱。
B.d 化学试剂
磷酸二氢钾〔KH2PO4〕、85%H3PO4、MeOH、CH3CN。所有溶剂均需经适用于水或有机溶剂的0.45μm滤膜过滤。
B.e LC流动相
pH2.4的0.2M KH2PO4的磷酸盐缓冲溶液。称取27.2gKH2PO4置于烧杯中，加水至950ml。在pH计上用H3PO4调节pH至2.4。倒入1L量筒中，加水至刻度定容，过滤。
C 样品与标准的制备
C.a 标准工作溶液
准确称取〔精确至0.1mg〕0.2000g ACS级奎尼酸、苹果酸和柠檬酸。在容量瓶中用水将混合酸定容至100ml，过滤。
C.b 样品溶液
用10ml Luer-Lok注射器抽取10ml CH3CN-H2O〔50+50〕洗提预处理柱。移去注射器，往柱子中通入10ml空气。将10ml样品进入预处理柱净化，弃去初始的4－5ml，收集其后的4－5ml。过滤，以备液相色谱分析。
D 测定
按100%MeOH〔甲醇〕[或MeOH-H2O(70+30)]、水、磷酸盐缓冲溶液顺序洗脱。工作结束时按相反顺序处理一遍，决不能使MeOH和磷酸盐缓冲溶液接触。操作条件：流速0.8ml/min。214nm检测；室温；灵敏度0.1AUFS。当蔓越桔混合果汁和〔或〕苹果汁中的糖峰和奎尼酸峰可以分离时，柱系统即满意。每注入两个样品后即注入5－20μl标准溶液以检查线性。注入5μl样品溶液。对标准和样品的响应用2次进样的平均值。洗脱顺序：奎尼酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸。
E 计算
奎尼酸、苹果酸、柠檬酸或富马酸%＝(PA/PA')×(V'/V)×C$$式中：PA和PA'分别为样品和标准的峰面积；V和V'分别为样品和标准的体积；C为标准溶液的浓度%。$$注：苹果酸标准(L-苹果酸或D-L-苹果酸)将产生2个峰，其中第2个峰是富马酸。苹果酸中的富马酸含量很小，标准大于等于99.9%，富马酸不计。杂质不影响分析。经维生素C强化的蔓越桔混合果汁将在苹果酸色谱峰后出现一个很强的色谱峰〔这是由于维生素C和莽草酸一起洗脱，并不定量〕。有关这一分离的详情见图20-2。
