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冻菜中的过氧化氢酶
加工过的蔬菜制品
- 滴定法
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A 试剂
A.a 磷酸盐缓冲溶液
0.1M，pH6.95±0.15。溶解15.22g K2HPO4·3H2O和4.54g KH2PO4于水中并稀释到1L。
A.b 含钼酸盐的硫酸溶液
2N。把55ml H2SO4加入约800ml水中，冷却，加入0.1g细粒(NH4)6MO7O24，搅拌直到全部溶解，用水稀至1L。
A.c 含有10%碘化钾的硫代硫酸钠〔大约0.01N〕溶液
溶解100g KI，2.50g Na2S2O3·5H2O，和约1g Na2CO3于500ml水中，稀至1L〔不用标定〕。
A.d 碘标准溶液
0.01N。用标准Na2S2O3溶液标定。
A.e 过氧化氢
0.1N。用冷水将0.58ml 30%的H2O2稀释到100ml。不用时在冰箱或冰浴中保存。当天配制。
A.f 含有20%葡萄糖的缓冲溶液
将20g葡萄糖溶解在100ml磷酸盐缓冲溶液(a)中，保存在冰箱里，使用一周。
A.g 淀粉指示剂
加1.0g可溶性淀粉于100ml冷水中，充分搅拌，加热至沸，两周配制一次。
B 提取液的制备
为了避免重金属氧化物的沾污，只能使用非金属或不锈钢刮勺处理样品。
B.a 湿菜或冻菜
将50g样品、约1gCaCO3及使总体积达200ml的水一起加入到高速搅拌机，混合3min。通过15cm的絮棉网状过滤器滤去较大的颗粒。在30min内分析滤液。
B.b 干菜
将50g样品、约1gCaCO3及使总体积达200ml的水一起加入到高速搅拌机，混合3min。通过15cm的絮棉网状过滤器滤去较大的颗粒。在30min内分析滤液。
C 测定
C.a 检验是否存在过氧化氢酶
Kf，等于在0℃下测定的一级反应常数k〔以10为底的对数〕除以样品克数/50ml反应混合物，Kf＝k/g，用此表示制品的过氧化氢酶的活度。根据不同的来源，纯过氧化氢酶的活度在40，000－60，000之间。如果要测定Kf，则除了把混合物的温度保持在0℃外，要严格按(a)操作。一般来说，除了这些之外，还应得到15min的滴定值。如果样品是高活度的酶，而不是蔬菜，应用稀的缓冲溶液溶解适当的量，pH6.5－7.5，最好含有2%的葡萄糖。
C.b 用Kt值精确测定过氧化氢酶的活度
向10ml提取液〔或少一些，视活度而定〕中加入水使总体积达43ml，加入5ml葡萄糖溶液(f)。混合，加入2ml 0.1N H2O2。加入H2O2后立刻充分混合，并迅速用快速移液管吸取反应完全的混合物中的“零时间”部分，吹入装有10ml H2SO4-钼酸盐溶液的125ml锥形瓶中。从移液管中放出溶液开始计算“零时间”。在5min和10min后分别取出10ml溶液。〔反应混合物温度必须保持20℃以下〕在1h内分别向每个锥形瓶中加入5ml Na2S2O3-KI溶液，混匀，放置3－5min；然后用约10滴淀粉为指示剂，用0.01N碘溶液滴定剩余的Na2S2O3。$$用水代替H2O2以测定空白，不到5min和10min时取出溶液，其它则严格按相同方式操作。空白溶液与含H2O2溶液的滴定值之差是在相应时间内与碘溶液相当的H2O2存在的量。“零时间”滴定值应该为0.5－2ml碘溶液；空白滴定值与“零时间”滴定值之差应为3.0－4.5ml的0.01N碘溶液。其差值小于3.0ml〔即碘的滴定值大于2ml〕，则说明H2O2很少，或是过氧化氢酶的活度很高，以至于大部分H2O2在“零时间”部分被取出以前就分解了。对于后一种情况，即使有大量过氧化氢酶存在，对应于5min和10min滴定之差将接近于零。在这种情况下，如果需要测定提取液中过氧化酶的含量，可以按(b)进行。如果使用10ml提取液，空白滴定值是4－6ml，“零时间”滴定值小于2ml，5min和10min的滴定值与“零时间”滴定值之差分别小于0.2ml和0.4ml，则说明过氧化氢酶不存在〔在实验误差范围内〕。
D Kf的计算
0－5min和5－10min的Kf应在0℃检验，但在较高温度时Kf(5－10min)将小于Kf(0－5min)，因为在较高温度下过氧化氢酶发很快的速度被H2O2去活。Kf按下述公式计算：$$Kf＝{[1/(t^^b－t^^a^^)log][(空白滴定值－t^^a^^时的滴定值)/(空白滴定值－t^^b^^时的滴定值)]}/(样品克数/50ml反应混合物)$$其中t^^a^^和t^^b^^是两次滴定值的初始时间和终止时间。对于按B提取的湿菜提取液，提取液的毫升数×0.25得到在反应混合物中样品的准确克数。若想得到更精确的结果，则需调节酶浓度；使空白滴定值与t^^0^^滴定值之差在3－4ml碘溶液，而与t^^10^^滴定值之差在0.5－1ml碘溶液。
