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冻菜中的过氧化物酶
加工过的蔬菜制品
- 滴定法
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A 试剂
A.a 磷酸盐-草酸盐缓冲溶液
0.1M，pH6.0。将14.2g Na2HPO4〔或26.81g Na2HPO4·7H2O〕和12.6g H2C2O4·2H2O加热溶解在水中，冷却，用1N NaOH调节pH到6.0，稀释到1L。
A.b 草酸溶液
1M。将126g H2C2O4·2H2O溶解在水中并稀释到1L。
A.c 氯化钠溶液
2.0%。将20g NaCl溶解于水中并稀释到1L。冷却到0℃，在0℃保存。
A.d 过氧化氢溶液
0.1N。用冷水将0.58ml 30%H2O2稀释到100ml。用碘量法进行标定，方法如下：向25ml 0.1N H2O2中加入10ml 4N H2SO4，6ml 1N KI，和3滴1N (NH4)6Mo7O24。用0.1N Na2S2O3滴定至淀粉变蓝。溶液不用时在冰箱里保存。每星期配制一次。
A.e 靛酚溶液
0.001N。将200mg 2.6-二氯靛酚或175mg Na盐或相当的产品溶解于水，稀释到1L。向50ml染料中加入10ml 1N KI和100ml 4N的H2SO4，用0.01N Na2S2O3滴定释放出的碘以标定靛酚。溶液在冰箱中保存。每星期配制一次。
A.f 抗坏血酸溶液
0.05mol/L。用0.1mol/L缓冲溶液(a)溶解880mg L-抗坏血酸，并稀释到100ml。当天配制。
B 提取液的制备
将50g新鲜的或冷冻的蔬菜组织加入到盛有200ml 2%NaCl冷溶液的高速搅拌机中，混匀。用15cm絮棉滤网过滤器除去较大的颗粒。在30min内分析滤液。
C 测定
向400ml烧杯中加入组织提取液和H2O2后，再加入75ml缓冲溶液(a)、50ml染料、5ml抗坏血酸，和足够的水，使总体积达250ml。用加热或冷却的办法调节温度到25±0.5℃。将烧杯放在电磁搅拌器上搅拌30s，搅拌速度以达到不剧烈冒泡为度。用移液管加入1－3ml提取液〔相当于0.2－0.4g样品〕，然后 用吹出式移液管快速加入5ml H2O2，加H2O2的同时开动秒表。在加H2O2过程中继续混合，直到取出第一份样品。$$在加入H2O2以后的15－30s中，用25ml速流移液管移出25ml反应混合物，放入装有5ml草酸溶液的125ml锥形瓶中，移液管中液体要在5s内排出。随后，以1min为间隔，取4－5次样品分别放入装有5ml草酸溶液的其它几个锥形瓶中。当移液管排空时记录时间。用染料溶液滴定剩余的抗坏血酸并计算一级反应常数。调节酶的活度使速率常数值约为15－20×10^-2^数量级，并且用K1/g样品表示过氧化物酶的活度Kf。当过了终点后呈现清晰的粉红色，并保持1min，滴定完成。与每一系列的第一个锥形瓶比较，使所有的滴定达到相同的终点。开始时滴定速度快一些，以后逐渐减慢滴定速度。
