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面粉和麦芽粉的蛋白质水解活性
谷物
- 消化法
- 〔适用于如特级面粉的低活性物质或者是活性蛋白质水解制品的稀提取物。〕
A 试剂
A.a 缓冲储备液
pH4.7。用H2O将120mlHOAc和164g无水NaOAc稀释到1L。使用前用H2O稀释20倍。
A.b Bacto
血红蛋白底物
A.c 三氯乙酸〔TCA〕溶液
将180g三氯乙酸溶于320mlH2O。
B 测定
B.a 酶溶液的制备
对于像面粉一样的微活性物质,直接将10g样品称入消化瓶。对于活性酶制品,在消化前立即制备稀缓冲溶液,A(a)中的提取液或悬浮液〔在消化混合物中所用提取液或稀释液的量可变动到2ml,对于酶提取物可应用合适的活化技术〕。
B.b 消化操作
各称2.50g〔无H2O基体〕Bacto-血红蛋白分别放入2个125ml锥形瓶中,在各瓶中加约5g或1匙细沸石和面粉样品(a)。转动搅拌混合直到面粉与底物完全混合。然后向每个瓶中加50ml预先在温控水浴中加热到40±0.1℃的稀醋酸缓冲溶液并搅拌混合到悬浮均匀。把塞紧的烧瓶放入40℃水浴中连续搅动或者每隔1h搅动一次。$$消化15min后向一个瓶中加10ml一份的TCA(c),而在消化5.25h后向第二个瓶中加10ml一份的TCA(c)。各瓶剧烈水平运动摇动25次,而且使瓶子在40℃水浴中准确保持30min。以1800r/min离心悬浮液5min,过滤〔像面粉一类的物质可能在最后过滤后仍然混浊;在最后过滤前应将已离心的消化混合物煮沸几秒钟使其变清。加H2O补充因蒸发而损失的液体〕。平行移取2份10ml的一份试液直接放入克氏瓶,测定可溶性N。$$在提取物的酶活性测定中基本按照同样操作进行,用总共2ml提取物或提取物加稀缓冲液代替固体物质。在起始时间和5h消化周期后,向各瓶中加10ml一份TCA溶液(c)。彻底混匀并在H2O浴中精确保持30min,不离心进行过滤。分析10ml一份样的可溶性N。
B.c 可溶性氮的测定
B.d 蛋白质水解活性的表示
利用对15min或起始时间消化和相应的长时间消化的返滴定体积的差值来量度蛋白质水解活性,计算为0.0714N NaOH毫升数。把对10ml一份样品所测定的蛋白水解活性变换为3/2次幂,将此值乘以6〔消化最后总体积/10ml一份样〕,再乘以1000/ml酶源。此值是以血红蛋白单位(HU)/g酶制品表示的活性。
B.e 图示法
B.f 标准曲线法
B.f.1 注意
从消化瓶颈小心地洗下TCA是必须进行的步骤。如果未中和,则TCA蒸气蒸馏。
B.f.2
如果在完成克氏测定过程中,没有在消化和蒸馏之间拖延,则将得到更多的再现性结果。
B.f.3
如果不是对10ml一份试样分析可溶性N,在换算为3/2次幂之前,将结果转换为10ml一份基质。如果用10ml一份试样时,滴定差值大于10ml 0.0714N NaOH,则用更少量的酶重行分析。对于大多数精确结果,滴定差值应为4.0-6.0ml 0.0714N NaOH。
B.f.4
对于大量血红蛋白,如果必要应调节缓冲储备液pH,使50ml稀缓冲液,2.5g血红蛋白和大约5g沸石的混合物pH应为4.70±0.05。对于缓冲基质混合物的这个pH是方法准确度的临界值。
B.f.5
只有当测定的滴定差值接近于5.00ml 0.0714N NaOH时,才能得到准确结果。对于单点法建议把滴定差的范围限制在4.0-6.0之间,但即使在这个范围的极值之内,对不同重量的酶样品的可溶性N的偏差在计算HU/g时将引起百分之几的差值。
B.f.6
图示法测定蛋白质水解活性具有的优点是准确使用5.00ml滴定差〔可溶性N增加5.00mg〕作为理想参考点。允许滴定差在3.0-8.0ml范围内使用。
B.f.7
在需要进行大量样品的常规分析中,用同样含量的标样和未知样的标准曲线是特别有用的。使用标样的优点是可以自动校核日常的微小的技术偏差。
B.f.8
对于常规分析使用0.0714N NaOH进行返滴定是很方便的,因为1ml滴定差=1ml可溶性N增量。