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食物中的肌醇六磷酸
谷物
- 阴离子交换法
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A 原理
肌醇六磷酸是用稀HCl从双份干食物中提取的。将提取物与EDTA/NaOH溶液混合并放在阴离子交换柱上。肌醇六磷酸以0.7M NaCl溶液洗脱并用浓HNO3/H2SO4混合液湿化消化释出P，比色测定，原样品中肌醇六磷酸的量按相当的六磷酸计算。
B 仪器
B.a 玻璃圆筒柱
0.7×15cm，具阀门。
B.b 阴离子交换树脂
AG1－X4，100－200目，氯型，利用〔根据下面方法〕测定肌醇六磷酸钠回收率来校核树脂。
B.c 微量克氏烧瓶
100ml，或25×200mm消化管。
B.d 微量克氏消化架。
B.e 分光光度计
在640nm读数。
C 试剂
C.a HCl
2.4%。加54ml HCl入1L容量瓶，用H2O稀释到刻度。
C.b NaCl溶液
0.1和0.7M。
C.c 磷酸盐标准溶液
0.8μg/ml。称0.350g干燥并保干的磷酸钾〔基准〕入1L容量瓶，加大约500ml H2O和10ml 10N H2SO4并用H2O稀释到刻度。溶液稳定。
C.d 钼酸盐溶液
2.5%钼酸铵的1N H2SO4溶液。将12.5g钼酸铵溶于200ml H2O，转入500ml容量瓶，加50ml 10N H2SO4，用H2O稀释到刻度。溶液稳定。
C.e 磺酸试剂〔1-氨基-2-萘酚-4-磺酸〕
将0.16g 1-氨基-2-萘亚甲基-4-磺酸，1.92g Na2SO3和9.60gNaHSO3溶于90mlH2O。定量转入100ml容量瓶。如有必要加热使溶解，用H2O稀释到刻度〔放在棕色瓶存于冰箱中，每周新配〕。
C.f Na2EDTA-NaOH试剂
在250ml容量瓶中加水搅拌10.23gNa2EDTA(0.11M)和7.5gNaOH(0.75M)。用H2O稀释到刻度。溶液稳定。
D 肌醇六磷酸标准曲线制备
将分光光度计调节到640nm并平衡不少于15min。$$移取1.0,3.0和5.0mlP标准溶液入50ml容量瓶。加约20mlH2O，彻底混合。加2ml钼酸溶液、1ml磺酸溶液，每加一样均混匀。用H2O稀释到刻度，混匀。15min后，在分光光度计640nm处读数。对典型的标准曲线计算：$$ $Tml标准溶液@μgP@A@浓度/A(K)$$1@80@0.1805@443.21$$3@240@0.516@465.12$$5@400@0.852@469.48$T
E 测定
准确称取约2.0000g样品放入125ml锥形瓶。加40ml 2.4%HCl(20ml20%HCl/g样品)。盖好瓶在室温剧烈振荡3h。$$同时制备柱子。往空固定柱上加30mlH2O，然后将0.5g树脂H2O浆灌入柱。树脂形成后用15ml 0.7M NaCl洗柱。再用15mlH2O洗。$$从振荡器上取下样品，通过Whatman2号滤纸真空抽滤。如果冷冻，样品提取物至少稳定1周。$$移取由1ml 2.4%HCl和1ml Na2EDTA-NaOH试剂混合的空白液，用H2O稀释到25ml。将此混合物灌注入柱。$$移取1.0ml滤液放入25ml玻璃塞刻度瓶。加10ml Na2EDTA-NaOH试剂，用H2O稀释到25ml，混合并定量转入柱。弃去流出液，用15ml H2O淋洗后再用15ml 0.1M NaCl淋洗，均弃去流出液。用15ml 0.7M NaCl淋洗，将其洗出部分收集于消化瓶，加0.5mlH2SO4和3.0mlHNO3入烧瓶，再加3个玻璃球，在把下一个样品加到柱上之前，将15mlH2O通过柱。1周或3个样品之后，弃去旧树脂，换新树脂。$$在通风柜内，微量克氏架上，在中热下消化直到明显沸腾停止，而且浓黄蒸气雾充满瓶颈。再在中热下，加热内容物5min。在低热下加热5min，然后关上炉子。$$瓶冷却时，加约10mlH2O，搅拌，或如有必要在低温下放置加热烧瓶，以溶解盐。在低温继续加热烧瓶10min。使溶液冷却，将溶液定量转入50ml容量瓶。加2.0ml钼酸盐溶液，加1.0ml磺酸试剂，每加一样均混匀。稀释到刻度，混匀。放置15min并在640nm读吸光值A。计算食品或饲料中的肌醇六磷酸：$$肌醇六磷酸mg/g样品＝“平均K”×A×20/(0.282×1000)$$式中A＝吸光度；“平均K”＝标准P(μg)/A/n〔标样〕；肌醇六磷酸＝28.2%P
