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混合饲料，预混合料和食物中的维生素A
维生素和其它营养物
- 比色法
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A 装置
A.a 光电比色计
低透光度比色计，使用匹配的吸收管，最好选用吸光度A与浓度成线性的仪器。
A.b Carr-Price试剂分配器
9或10ml全玻璃制品，为便于迅速地分送试剂其开孔直径3－4mm。
A.c 色谱柱
A.c.1 用于人造奶油和奶油
9×100－120mm玻璃管，一端与20×40－50mm储液槽连接，另一端与5×60mm管连接，并塞上塞子。
A.c.2 用于其它产品
18〔内径约12mm〕×200mm玻璃管与5×100mm的玻璃管封接。
A.d 洗脱液接受器
分部收集器或配以双孔塞子的100ml无嘴量筒，一孔与色谱柱相连，另一孔插入一根玻璃弯管与真空泵连接。用水泵抽真空。
A.e 碱消化〔水解〕装置
连接用水冷却回流装置与250或500ml长颈蒸馏烧瓶，以适宜的体积在其颈部标上刻度〔例如，250ml烧瓶在260ml处标上刻度〕。于沸水或蒸汽浴上加热，或用带电磁搅拌的电热板加热。人造奶油和奶油用适宜体积标度的125mL长颈烧瓶。
A.f 提取装置
50－60ml重型离心管，配以玻塞或衬聚四氟乙烯的螺旋盖〔检查是否泄漏〕。对于低效价的样品，提取量较大，可用125或250ml的分液漏斗〔不带橡皮塞〕。提取人造奶油和奶油，用特制的65ml离心试管〔聚四氟乙烯衬里的无盖管〕。
A.g 紫外灯
长波长型，360nm，仅使用低强度灯。
A.h 蒸发装置
将Y型管的两臂改成U型，与裹有锡箔或聚四氟乙烯薄膜的塞子连接〔以密封〕，顶臂通过回流安全瓶与水泵相连接，并加装2通活塞以接通与切断真空泵，通过流体压力计测量真空度。将盛有小于等于10ml维生素A溶液的比色管与装置连接〔每次两个〕，于60－65℃水浴上加热，轻轻振摇，以免暴沸和迅速蒸发，在部分真空或N2气流下操作均可。浓缩较大体积的提取液时，可用由三通活塞构成的50－200ml简易真空装置，一臂与烧瓶连接，一臂经汽水分离器与真空系统连接，第三个臂封接到由试管制作的直立储液器上，以便切断真空或使用旋转蒸馏装置时由此加入试剂。
B 试剂
B.a 吸附剂
氧化铝，中性，活度为一级，加5g水于带玻塞的小瓶里，再加入95g氧化铝，振摇混匀，直至无团块为止。用前静置、冷却2h以上。必要时可按C调节其活度，将吸附剂恰好装满小瓶，密闭保存。注意控制水分，无论是原装的还是制备好的氧化铝都不应暴露于空气中。
B.b 三氯甲烷
试剂级，若不澄清，需蒸馏提纯，弃去最初和最后的10%蒸馏出液。蒸馏得到的三氯甲烷超过一周则弃去不用。
B.c 已烷
试剂级，或由全玻装置重蒸优质市售已烷，收集64－68℃馏分。必须不含醇、酯和酮。
B.d 乙醇
95%。
B.e 丙酮已烷液
4%和15%，将试剂级丙酮用(c)已烷稀释。
B.f 清除比色管中SbCl3的溶液
以HCl洗涤或用加有少量洗涤剂的10%Rochelle盐溶液浸泡，并用热洗涤液仔细洗净。
B.g 氢氧化钾溶液
溶解70g试剂级KOH于70ml水中，混匀，冷却。每次须重新配制。
B.h 显色剂
B.h.1 三氯化锑
20%。〔注意：SbCl3有毒，且有腐蚀性，应避免接触。〕从未开启的密封瓶中取出试剂级SbCl3晶体〔如瓶内有液体或有颜色或晶体已潮解和粘结，则不能再用〕100g溶于CHCl3中，并稀释至500mL，可微微加热和振摇直至溶解。冷却后加入15ml AC2O。如溶液不澄清，则应过滤、离心或让其沉降倾出上清液。操作应迅速，以缩短晶体或制备好的试剂在空气中暴露的时间。用棕色瓶密闭保存，试剂的稳定期不少于2个月。
B.h.2 三氟乙酸〔TFA〕溶液
B.i 维生素A参比液
美国药典参比标准溶液，该标准液为含全反式视黄醇醋酸酯晶体的棉子油溶液，每克油相当于含30mg视黄醇〔维生素A醇〕，或按说明书为准。
B.j 胡萝卜素参比晶体
C 吸附柱
D 标定
测定所有试剂〔包括棉子油〕的空白，空白吸光度值应近于零。
D.a 维生素A标准曲线的制备
如在色谱分离过程中胡萝卜素已被分离出来，则可按24-2D测定其浓度。$$如维生素A的15%丙酮-已烷洗脱液中含黄色色素，则如测定胡萝卜素那样，用440nm滤光片测定透光度T〔或吸光度A〕，用维生素A蓝色反应的吸光度A以及所需要的稀释因素〔若在440nm和620nm时没按1：10的体积比〕计算黄色色素的校正因子D(c)。$$按A(h)于60－65℃水浴中真空蒸发溶液，残余物溶于1ml CHCl3中，以1ml CHCl3与一定量〔9或10ml〕的SbCl3〔或TFA〕试液于620nm下调节比色计至100%T〔或0%A〕。〔在一系列测定中，该点必须保持稳定，必要时应重新调节。〕将盛有1ml含维生素A的CHCl3溶液的比色管置于仪器中，在1－2s内加入一定体积的SbCl3试剂，当出现第一个瞬时停顿点时，读取T〔或A〕〔T应在20－80%范围内〕。读数要快，因为在3－5s之后，颜色将开始消褪，透光度T会缓缓升高。加入SbCl3后不能再调节仪器。在短时间内检查管内容物，溶液应呈蓝色，不浑浊。蓝色应消褪。$$将已知量的维生素A加入样品中，按照整个操作步骤进行分析，以确定所测维生素A的回收率R。
D.b 胡萝卜素标准曲线的制备
制备一系列胡萝卜素已烷稀释液，以440nm下测得的吸光度值对胡萝卜素的μg数作图，用曲线或校正因子求出样品中胡萝卜素含量。
D.c 测定维生素A洗脱液中黄色素的校正因子
E 样品的制备与保存
E.a 干的混合饲料和预混合料
收集600－800g大样，置于密闭的玻璃或塑料容器中于暗处冷冻保存。分析前立即加温至室温。研磨全部样品，使大于等于95%的样品通过20目筛，于纸上翻动或用类似的方法混匀，再研磨，再混匀，〔研磨有助于样品中珠状高效价维生素A产品的破碎与分散。〕取样〔操作中应避免损失微小颗粒〕。对某些含稳定性维生素A的高效价产品〔如维生素A含量大于等于30μg/g〕。开始研磨和取样前，最好用新磨碎的谷物稀释后再取样。已研磨的样品保存期不能超过一周。
E.b 食物
收集600－800g大样，置于密闭的玻璃或塑料容器中于暗处冷冻保存。分析前立即加温至室温。研磨全部样品，使大于等于95%的样品通过20目筛，于纸上翻动或用类似的方法混匀，再研磨，再混匀，〔研磨有助于样品中珠状高效价维生素A产品的破碎与分散。〕取样〔操作中应避免损失微小颗粒〕。对某些含稳定性维生素A的高效价产品〔如维生素A含量大于等于30μg/g〕。开始研磨和取样前，最好用新磨碎的谷物稀释后再取样。已研磨的样品保存期不能超过一周。
E.c 液体饲料添加剂和预混合物
置于密闭的玻璃容器或塑料容器中，存放于不低于8℃的低温处。分析前立即加热至35－40℃。经反复倾倒或搅拌使其混匀后取样。
E.d 人造奶油和奶油
贮于冰箱中，避免光照或受热。仅于分析前软化两份以上100g的样品。纵向切成小块，再从每个小块上随机地切取样品；或用端部切割成斜角的塑料注射器插入切块的任意部位取样；取2或3块水平向切块并做成管状，取样呈块状。取样前切勿将人造奶油和奶油混合，因混合可导致从某些样品中水的分离，而不能复原。保持样品的原装包装，不要混合，贮于冰箱中。
F 测定
〔在柔光下操作，避免实验室高温，仔细按照下面的说明，快速完成各项操作。当离心含乙醚和已烷的溶剂时，应使用防暴离心机〕
F.1
F.2
产品中维生素A含量为5000－20000unit/lb，称取20－40g样品至250－500ml烧瓶中。
F.3
产品中维生素A含量为20000－80000unit/lb。称取10－20g样品至250ml烧瓶中。
F.4
F.a 碱消化〔水解〕
F.a.1 混合干样，预混合物和半湿食品
以ml计加4倍于样品g数的乙醇大于等于40ml，混匀。边搅拌边缓慢加入相当于样品克数的KOH溶液(ml)，且KOH量大于等于10ml。将搅拌棒置于烧瓶中，以约2滴/s的速度回流30min。回流过程中至少搅动三次烧瓶，以分散形成的凝聚物，或于电热板上用磁搅拌器搅拌加热。〔对于有些样品，放入搅拌棒搅动比电磁搅拌分散效果更好〕。迅速冷至室温，加乙醇-水(3+1)溶液至容器刻度下20－30ml处。振摇混匀，加乙醇-水(3+1)溶液至刻度，再次混匀。〔选用大小适宜的烧瓶，以使维生素浓度适于下面的分析，切勿稀释过度。〕让悬浮物沉降。静置后若烧瓶中溶液呈单一均相，则进行(b)项操作，如不然，参阅(b)(2)。〔含糖量高的样品会在烧瓶壁上形成一层粘膜，但只要烧瓶内容物充分混匀，显然不会带来困难。〕
F.a.2 液体样品〔含糖密添加剂，液体早餐饮料等〕
产品中维生素A含量小于等于1500μg/kg，称取大于等于40g样品按照24-1E将样品置于500ml长颈烧瓶中。
F.a.3 人造奶油与奶油
以ml计加4倍于样品g数的乙醇大于等于40ml，混匀。边搅拌边缓慢加入相当于样品克数的KOH溶液(ml)，且KOH量大于等于10ml。将搅拌棒置于烧瓶中，以约2滴/s的速度回流30min。回流过程中至少搅动三次烧瓶，以分散形成的凝聚物，或于电热板上用磁搅拌器搅拌加热。〔对于有些样品，放入搅拌棒搅动比电磁搅拌分散效果更好〕。迅速冷至室温，加乙醇-水(3+1)溶液至容器刻度下20－30ml处。振摇混匀，加乙醇-水(3+1)溶液至刻度，再次混匀。〔选用大小适宜的烧瓶，以使维生素浓度适于下面的分析，切勿稀释过度。〕让悬浮物沉降。静置后若烧瓶中溶液呈单一均相，则进行(b)项操作，如不然，参阅(b)(2)。〔含糖量高的样品会在烧瓶壁上形成一层粘膜，但只要烧瓶内容物充分混匀，显然不会带来困难。〕
F.b 提取
F.b.1 维生素A含量>1500μg/lb的样品
F.b.2 对于(a)(1)中分成两液相的样品
F.b.3 样品中维生素A含量<1500μg/lb，需提取>15ml的水解液或含有可测量的类胡萝卜素色素的产品
F.b.4 人造奶油和奶油
F.c 色谱分离
将Y型管的两臂改成U型，与裹有锡箔或聚四氟乙烯薄膜的塞子连接〔以密封〕，顶臂通过回流安全瓶与水泵相连接，并加装2通活塞以接通与切断真空泵，通过流体压力计测量真空度。将盛有小于等于10ml维生素A溶液的比色管与装置连接〔每次两个〕，于60－65℃水浴上加热，轻轻振摇，以免暴沸和迅速蒸发，在部分真空或N2气流下操作均可。浓缩较大体积的提取液时，可用由三通活塞构成的50－200ml简易真空装置，一臂与烧瓶连接，一臂经汽水分离器与真空系统连接，第三个臂封接到由试管制作的直立储液器上，以便切断真空或使用旋转蒸馏装置时由此加入试剂。
F.d 比色测定
F.e 维生素A含量的计算
维生素A的μg数G/g＝(Cu－Cc)×[V/〔W×R〕]$$或 维生素Aμg/lb＝(Cu－Cc)×V×[454/〔W×R〕]$$其中Cu为由曲线或因子得到的未经校正的维生素A浓度；Cc为校正过的维生素A洗脱液中黄色色素的浓度；V为样品提取液的最终体积；W为样品g数；R为维生素A的回收率。$$〔注：如水解后烧瓶中仍有固体，则结果可能略有偏高，除了样品量较大及烧瓶中的溶液体积相对很小的情况下，固体物的体积可忽略不计。在这种情况下，误差可小于等于5%。因为有些样品乘下大量未水解残渣而另一些样品则不剩，因此固体体积的校正是很困难的。最大校正值的估算可以10g原料为基准，按水解烧瓶中溶液体积减少3ml考虑。如需要，可采用估算校正〕
F.f 将人造奶油和奶油中维生素A和胡萝卜素含量转化成维生素A活性单位与视黄醇当量
维生素A活性单位＝〔维生素Aμg×3.33〕+〔胡萝卜素μg×1.67〕$$以视黄醇当量表示维生素A活性＝〔维生素μg〕+〔胡萝卜素μg/6〕
