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食物中的硫胺素〔维生素B1〕
维生素和其它营养物
- 荧光法
- 〔本法不适用于有吸附硫胺素的物质或含有影响硫色素荧光的外来杂质的存在〕
A 试剂和仪器
A.a 2当量醋酸钠溶液
溶解272g NaOAc·3H2O于水中，稀释至1L。
A.b 溴甲酚绿pH指示剂
将0.1g指示剂与2.8ml 0.05N的NaOH溶液于玛瑙研缸中研磨溶解，用水稀释到200ml。变色范围：4.0〔绿〕－5.8〔蓝〕。
A.c 溴酚蓝指示剂
将0.1g指示剂与3.0ml 0.05N的NaOH溶液于玛瑙研缸中研磨溶解，用水稀释到250ml。变色范围：3.0〔黄〕－4.6〔蓝〕。
A.d 酶溶液
当天配制。10%酶制剂水溶液应具有淀粉酶和磷酸酶的活性〔α-淀粉酶〕。用硫胺素的一、二和三磷酸盐检验每批酶制剂的性能，若回收率大于85%，则酶制剂是适宜的。
A.d Bio-Rex70〔氢型〕
50－100目。将300ml 2N HCl加到50gBio-Rex70中，搅拌15min，倾出上清液，重复数次。加300ml水，搅拌1min，倾出上清液，重复数次，直至水溶液的pH为4.5－7.0为止。静置15s水中应无悬浮树脂，否则，应重复洗涤直至水层澄清为止。
A.f 色谱柱
玻璃色谱柱〔总长约275mm，贮液槽容量约60ml〕，按以下尺寸〔外径×长度mm〕将三部分熔接在一起。〔1〕顶部贮液槽，35×39；〔2〕中部吸附管，8×145；〔3〕下部毛细管，长35mm，直径由下列参数确定：当管内充填吸附剂后，流速应小于等于1ml/min。按下法制备好色谱柱备用：借助于玻棒，将细玻璃棉塞入毛细管顶端，将树脂悬浮液倾入吸附柱中，使高度约为100mm。务必洗下贮液槽壁上的所有树脂颗粒。整个吸附过程中液面须始终高于树脂表面，以防止空气进入吸附柱。[将橡皮帽充满水〔防止含有空气〕置于毛细管低端的上方，可防止柱中液体流干。]
A.g 中性氯化钾溶液
溶解250g KCl于水中，稀释至1L。
A.h 酸性氯化钾溶液
加8.5ml HCl于1L中性氯化钾溶液中。
A.i 氢氧化钠溶液
15%。溶解15g NaOH于水中，稀释至100ml。
A.j 铁氰化钾溶液
1%。溶解1g K3Fe(CN)6于水中，稀释至100ml。使用当天配制。
A.k 氧化剂
将4.0ml 1%K3Fe(CN)6溶液用15%NaOH混合，使全量为100ml。在4h内使用。
A.l 异丁醇
在全玻璃装置中重蒸馏，重蒸物作为无水或水饱和物使用。
A.m 硫酸奎宁贮备液
用以调节荧光计的重现性。溶解10mg硫酸奎宁于0.1N H2SO4中，使全量为1L，作为原液，贮于避光容器中。
A.n 硫酸奎宁标准液
将1份硫酸奎宁贮备液用39份0.1N的硫酸稀释，作为标准液，贮于避光容器中。〔该溶液的荧光强度与从1μg盐酸硫胺素获得的硫色素异丁醇提取液的荧光强度大致相等。〕
A.o 盐酸硫胺素标准液
A.o.1 贮备液
100μg/ml。准确称取50－60mg已于P2O5干燥器中干燥至恒重的美国药典盐酸硫胺素参比标准，溶于已用盐酸将pH调至3.5－4.3的20%乙醇中，并稀释至500ml。加入足够量的酸化乙醇使盐酸硫胺素的浓度为100μg/ml。盛于避光玻塞瓶中，于约10℃下保存。
A.o.2 中间溶液
10μg/ml。100ml贮备液用20%pH为3.5－4.3的盐酸酸化乙醇稀释至1L，盛于避光玻塞瓶中，于约10℃下保存。
A.o.3 工作溶液
B 提取
B.a 含游离硫胺素的样品〔不适用于含焦磷酸硫胺素的样品〕
B.a.1 含碱性物不多的干样或半干样品
以ml计加入大于等于10倍干样品克数的0.1N HCl，如样品不易溶解，则应进行磨碎，使其均匀地分散于液体中，若出现块状物，则锰烈搅拌使所有颗粒与溶液接触，然后用0.1N HCl洗下粘于瓶壁上的样品，在不断搅拌下于95－100℃的蒸汽浴或沸水浴中消化30min，或于121－123℃下高压消化混合物30min。冷却，如出现块状物则再次搅拌混合，直至所有颗粒都分散均匀为止。用0.1N HCl稀释一定体积〔即每毫升约含硫胺素0.2μg〕，指定该溶液为分析样液。
B.a.2 含碱性物较多的干样或半干样品
以ml计加入大于等于10倍干样品克数的0.1N HCl，如样品不易溶解，则应进行磨碎，使其均匀地分散于液体中，若出现块状物，则锰烈搅拌使所有颗粒与溶液接触，然后用0.1N HCl洗下粘于瓶壁上的样品，在不断搅拌下于95－100℃的蒸汽浴或沸水浴中消化30min，或于121－123℃下高压消化混合物30min。冷却，如出现块状物则再次搅拌混合，直至所有颗粒都分散均匀为止。用0.1N HCl稀释一定体积〔即每毫升约含硫胺素0.2μg〕，指定该溶液为分析样液。
B.a.3 液体样品
用稀HCl调节混合物pH约4.0，加适量水，使液体总体积〔毫升〕大于等于10倍干样品克数。每100ml液体加入1ml 10N HCl，按〔1〕进行操作。
B.b 含焦磷酸硫胺素的样品
以ml计加入大于等于10倍干样品克数的0.1N HCl，如样品不易溶解，则应进行磨碎，使其均匀地分散于液体中，若出现块状物，则锰烈搅拌使所有颗粒与溶液接触，然后用0.1N HCl洗下粘于瓶壁上的样品，在不断搅拌下于95－100℃的蒸汽浴或沸水浴中消化30min，或于121－123℃下高压消化混合物30min。冷却，如出现块状物则再次搅拌混合，直至所有颗粒都分散均匀为止。用0.1N HCl稀释一定体积〔即每毫升约含硫胺素0.2μg〕，指定该溶液为分析样液。
C 酶水解
取一份约含10－25μg硫胺素的溶液，以0.1N HCl稀释至约65ml，并用约5ml 2N NaOAc调节pH至4.0－4.5，可用pH计测量或在滴试板上用溴甲酚绿指示剂检验，当颜色确实变为蓝色时则为终点。加5ml酶溶液，混匀，于45－50℃培养3h。冷却，用溴酚蓝指示剂或pH计检验，将pH调至约3.5，用水稀释至100ml，用不吸附硫胺素的滤纸过滤〔无灰滤纸可满足要求〕。
D 纯化
将1份约含5μg硫胺素的滤液通过制备好的色谱柱，用3份5ml近沸热水洗涤色谱柱，切勿让液面低于树脂表面。$$用5份4.0－4.5ml近沸〔大于60℃〕酸性氯化钾溶液洗脱吸附于树脂上的硫胺素，在加入最后1份洗脱液前切勿让液面低于树脂表面，洗脱液收集于25ml容量瓶中，冷却后用酸性氯化钾溶液稀释至刻度。指定该溶液为分析样液。
E 硫胺素氧化为硫色素
至少取4支约40ml的试管，在各管中加入约1.5g NaCl或KCl及5ml分析标准液。〔结果的精度和准确性取决于下面氧化处理操作的一致性。当照会破坏硫色素。因此溶液需避光。加氧化剂的移液管须满足能在1－2s内放出3ml液体的要求。〕将吸有氧化剂的移液管管尖置于试管颈部，勿摆动，使液流不碰到试管壁。缓慢旋摇试管，使其中的液体产生旋转，立即加入3ml氧化剂，取出移液管后再次旋摇，确保混匀。立即加入13ml异丁醇，塞好塞子，剧烈振摇大于等于15s。用同样方法再处理至少1支试管，剩余的试管〔多于2支，作标准空白用〕除用15%NaOH代替氧化剂外仍用与前面相同的方法处理。$$取4支以上相同的试管，分别加入5ml分析样液，以处理标准工作溶液试管相同的方法处理。$$当所有试管均加入异丁醇后，再振摇约2min〔可将试管置于振荡器上振摇〕。低速离心直至得到清晰上清液为止。从各试管中吸取或倾泻约10ml异丁醇提取液〔上液层〕，置于比色池中测定硫色素的荧光。
F 硫色素荧光的测定
〔氧化试样分析液中的硫胺素含量是通过将其提取液的荧光强度与氧化标准液的荧光强度进行对比确定的，荧光强度与硫胺素含量成正比，可选用适宜的荧光计测量。已发现窄透光度T范围的输入滤光片具有最大波长约为365nm和窄透光度T范围的激发滤光片具有最大波长约为435nm是满意的。用硫酸奎宁标准溶液控制荧光计的重现性。〕$$首先测量氧化分析样液异丁醇提取液的荧光强度〔I〕，接着测量用3ml 15%NaOH溶液处理过的分析样液异丁醇提取液的荧光强度(b)，然后测量氧化分析标准液异丁醇提取液的荧光强度〔S〕，最后测得用3ml 15%NaOH溶液处理过的分析标准液异丁醇提取液〔标准空白〕的荧光强度(d)。
G 计算
按下式计算：$$5ml分析液中的盐酸硫胺素(μg)＝〔I－b〕/〔S－d〕
