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食物和维生素制品中的核黄素〔维生素B2〕
维生素和其它营养物
- 荧光法
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A 仪器
A.1 荧光计
用适于准确测量核黄素浓度为0.05－0.2μg/ml溶液荧光的荧光计。已发现透光度T范围窄最大波长约为440nm的激发滤光片和透光度T范围窄最大波长约为565nm发射滤光片是适宜的。
B 试剂
〔切勿振摇贮于甲苯下面的标准溶液〕
B.a 核黄素标准液
B.a.1 贮备液
100μg/ml。将50g预先干燥并于暗处贮于P2O5干燥器中的核黄素参比标准溶于0.02N HOAc中，定容至500ml〔为加速溶解，可将约300ml 0.02N HOAc溶液于蒸汽浴上加热，不断搅拌，待溶解完全后，冷却，以0.02N HOAc溶液定容至500ml〕。贮存于甲苯下约10℃。
B.a.2 中间溶液
10μg/ml。取100ml贮备液用0.02N HOAc配制为1L。在甲苯下约10℃保存。
B.a.3 工作溶液Ⅰ
1μg/ml。取10ml中间溶液，用水稀释至100ml。每次分析需新配制。该液用作标准溶液。
B.a.4 工作溶液Ⅱ
0.1μg/ml。取10ml中间溶液，用水稀释至1L。每次分析需新配制。该液用作标准溶液。
B.b 连二亚硫酸钠
B.c 提取液
将300ml甲醇，100ml吡啶，100ml水和10ml HOAc混匀。〔也可按比例配制。〕
C 样品溶液的制备
〔整个操作中，溶液须避光且保持pH<7.0，如用滤纸直接过滤，则需用确知不吸附核黄素的滤纸，已发现无灰滤纸是适宜的。〕$$将已知量样品置于大小适宜的烧瓶内，按下述方法之一制备：
C.a 含碱性物质不多的干样或半干样品
以ml计加入大于等于10倍干样品克数的0.1N HCl，使最终溶液的核黄素含量小于等于0.1mg/ml。如样品不易溶解，可将其磨碎，使均匀地分散于液体中，然后锰烈搅拌，并用0.1N HCl冲洗烧瓶壁。$$于121－123℃高压釜内加热混合物30min，然后冷却。若出现块状物，可持续搅动直至颗粒均匀分散。在剧烈搅动下，用NaOH溶液调节pH至6.0－6.5，然后立即加稀盐酸直至再无沉淀形成〔通常pH约为4.5，即多数蛋白质的等电点〕。$$将混合物稀释至一定体积，使其核黄素含量>0.1μg/ml。然后用滤纸过滤。〔若混合物难于过滤，可离心和/或通过烧结玻璃过滤并加适宜的分析用助滤剂，常代替滤纸过滤，或先用烧结玻璃过滤，再用滤纸过滤。已发现无灰过滤纸浆和分析用硅藻土助滤剂是适宜的。〕取出1份清晰的滤液，先滴加稀HCl检查可溶性蛋白质，如无沉淀生成，则在锰烈搅动下滴加NaOH，并按以下方式进行：
C.a.1
如再无沉淀生成，则在剧烈搅动下，用NaOH溶液调pH至6.8，稀释溶液至最终一定量的体积，使其核黄素含量约为0.1μg/ml。如出现浑浊，可再次过滤。
C.a.2
如再无沉淀生成，则在剧烈搅动下，用NaOH溶液调pH至6.8，稀释溶液至最终一定量的体积，使其核黄素含量约为0.1μg/ml。如出现浑浊，可再次过滤。
C.b 含碱性物质较多的干样或半干样
以ml计加入大于等于10倍干样品克数的0.1N HCl，使最终溶液的核黄素含量小于等于0.1mg/ml。如样品不易溶解，可将其磨碎，使均匀地分散于液体中，然后锰烈搅拌，并用0.1N HCl冲洗烧瓶壁。$$于121－123℃高压釜内加热混合物30min，然后冷却。若出现块状物，可持续搅动直至颗粒均匀分散。在剧烈搅动下，用NaOH溶液调节pH至6.0－6.5，然后立即加稀盐酸直至再无沉淀形成〔通常pH约为4.5，即多数蛋白质的等电点〕。$$将混合物稀释至一定体积，使其核黄素含量>0.1μg/ml。然后用滤纸过滤。〔若混合物难于过滤，可离心和/或通过烧结玻璃过滤并加适宜的分析用助滤剂，常代替滤纸过滤，或先用烧结玻璃过滤，再用滤纸过滤。已发现无灰过滤纸浆和分析用硅藻土助滤剂是适宜的。〕取出1份清晰的滤液，先滴加稀HCl检查可溶性蛋白质，如无沉淀生成，则在锰烈搅动下滴加NaOH，并按以下方式进行：
C.c 液体样品
用稀HCl调节混合物pH为5.0－6.0，加适量水，以ml计使液体总量大于等于10倍干样品克数〔溶液的核黄素含量必须小于等于0.1mg/ml〕。然后以每100ml液体加1.0ml 10N HCl计加酸，并按(a)进行操作，从第二句开始。
C.d 浓缩物，预混合物和多种维生素添加物
取4支以上试管〔或反应器〕，分别加入10ml样品溶液〔如荧光计配置的比色池为圆管型，则所有的反应均应在这些已匹配的比色管中进行〕。对其中2支或2支以上试管，各加1ml核黄素标准工作液Ⅰ，混合。在剩余的试管中，各加入1ml水，混匀。在所有试管中分别加入1ml HOAc，混匀，在不断混合下，加0.5ml 4% KMnO4溶液，〔如样品含大量可氧化物质，可适当增加KMnO4溶液，以完全氧化这些外来物质，过量小于等于0.5ml。〕静置2min，在不断混合下，于各管分别加入0.5ml 3% H2O2溶液，则高锰酸盐的颜色反应在10s内褪去。剧烈振摇直至赶出所有过剩的氧，停止发泡后，如仍有气泡附在管壁上，可将管倾斜，使溶液缓慢地从一端流至另一端，从而将气泡排出。$$用荧光计测定加有1ml核黄素标准工作液Ⅰ的样品液的荧光值〔X〕，接着测量加有1ml水的样品液的荧光值〔B〕，在混合下对至少2支试管各加20mg粉状Na2S2O4，于5s内测量最小荧光值〔C〕。以所取那份样液量为基准，按下式计算：$$核黄素mg/ml最终样液＝[〔B－C〕/〔X－B〕]×0.10×0.001[式中〔B－C〕/〔X－B〕值应大于等于0.66，而小于等于1.5]$$注意：>20mg的Na2S2O4可能会还原外来色素和/或外来荧光物质，从而导致错误结果。
E 测定
取4支以上试管〔或反应器〕，分别加入10ml样品溶液〔如荧光计配置的比色池为圆管型，则所有的反应均应在这些已匹配的比色管中进行〕。对其中2支或2支以上试管，各加1ml核黄素标准工作液Ⅰ，混合。在剩余的试管中，各加入1ml水，混匀。在所有试管中分别加入1ml HOAc，混匀，在不断混合下，加0.5ml 4% KMnO4溶液，〔如样品含大量可氧化物质，可适当增加KMnO4溶液，以完全氧化这些外来物质，过量小于等于0.5ml。〕静置2min，在不断混合下，于各管分别加入0.5ml 3% H2O2溶液，则高锰酸盐的颜色反应在10s内褪去。剧烈振摇直至赶出所有过剩的氧，停止发泡后，如仍有气泡附在管壁上，可将管倾斜，使溶液缓慢地从一端流至另一端，从而将气泡排出。$$用荧光计测定加有1ml核黄素标准工作液Ⅰ的样品液的荧光值〔X〕，接着测量加有1ml水的样品液的荧光值〔B〕，在混合下对至少2支试管各加20mg粉状Na2S2O4，于5s内测量最小荧光值〔C〕。以所取那份样液量为基准，按下式计算：$$核黄素mg/ml最终样液＝[〔B－C〕/〔X－B〕]×0.10×0.001[式中〔B－C〕/〔X－B〕值应大于等于0.66，而小于等于1.5]$$注意：>20mg的Na2S2O4可能会还原外来色素和/或外来荧光物质，从而导致错误结果。
