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    维生素制剂中维生素D

    维生素和其它营养物

    液相色谱法
        〔适用于含量大于等于100,000IU胆钙化醇或维生素D3/g的油剂;大于等于20,000,000IU胆钙化醇/g的树脂状样品;和大于等于25000IU胆钙化醇/g的粉剂和水悬浮剂。〕
    A 原理
        干的浓缩物及水悬浮剂被皂化和提取。维生素D树脂及油性溶液溶解在溶剂中。用液相色谱将维生素D及维生素D前身与杂质分开。用校正因子将维生素D前身换算成维生素D。维生素D是维生素D和维生素D前身的总和。
    B 仪器
        
    B.a 液相色谱仪
        具有254nm紫外检测器。典型的操作条件:纸速1cm/ml;洗脱液流速2ml/min〔约100atm〕;检测器灵敏度0.128AUFS;温度:室温;阀进样体积20μl。
    B.b 色谱柱
        不锈钢150×4.6〔内径〕mm,用5μm粒度的Si60填装,通过系统适用性试验,在进柱以前,流动相必须被抽送通过100cm×4mm不锈钢柱,其内填充有经250℃干燥4h的50-250μm硅胶。只要系统适应性试验符合要求,则不同的柱长,和不同牌号的填料可被替代,且进样量也可在10-30μl间变化。
    C 试剂
        
    C.a 正已烷
        光谱纯,通过60×8cm直径的柱子干燥,柱子中装有500g经150℃干燥4h的50-250μm硅胶。
    C.b 正戊醇
        试剂级。
    C.c 流动相
        正已烷和正戊醇(997+3),必要时调节组分比例以满足适应性试验。
    C.d 甲苯
        试剂级或毫微级。
    C.e 维生素D标准溶液
        准确称取约80mg USP胆钙化醇参比标准于50ml棕色容量瓶中,不加热将其溶于甲苯中,并以甲苯稀释定容。每日新鲜配制。
    C.f 适应性标准溶液
        制备溶液使每克植物油中含维生素D3 2mg和反式维生素D3 0.2mg,将此溶液0.25g于10ml甲苯-流动相(1+1),反式维生素D3及维生素D3前身应具有大致相同的峰。必要时可在90℃温热油溶液约45min,以增加维生素D3前身的含量。油于5℃贮存。
    C.g 抗坏血酸钠溶液
        将3.5g抗坏血酸溶解于20ml 1N NaOH中。每日新鲜制备。
    C.h 硫化钠溶液
        将12g Na2S·9H2O溶解于20ml H2O中,再用87%甘油稀释至100ml。
    C.i 氢氧化钾溶液
        
    C.i.1 50%(w/w)
        将50g KOH溶解于50ml H2O中,并冷却,新鲜制备。
    C.i.2 3%乙醇溶液
        将3g KOH溶解于水中,加10ml乙醇,并用水稀释至100ml。新鲜制备。
    C.j 乙醚
        不含酸和过氧化物。
    D 系统适应性试验
        取适应性标准溶液20μl作色谱检测6次。采用计算标准偏差和相对标准偏差来测定峰高的稳定性。相对标准偏差=标准偏差×100/平均峰高,来测定峰高的稳定性,相对标准偏差应小于等于1%。$$测定维生素D3前身及反式维生素D3的峰分辨率(R):$$ R=2D/(B+C)$$式中D=原维生素D3前身与反式维生素D3峰顶之距离;B=维生素D3前身的峰宽;C=反式维生素D3的峰宽。维生素D3前身与反式维生素D3的峰分辨率应大于等于1.0。
    E 校正因子的测定
        吸取维生素D标准溶液(e)4ml至25ml容量瓶中。加入1ml甲苯并用流动相稀释至刻度,贮存于冰浴中。经进样阀向色谱柱注入20μl样品并调整检测器操作条件使之标尺上得到的峰高最大。重复进样并计算平均峰高〔=K〕。$$吸取维生素D标准溶液(e)5ml至25ml容量瓶中,加几粒丁基化羟甲苯晶体。通氮气置换空气,连接回流冷凝器。在暗处且通氮条件下于90℃水浴上加热,然后冷却。用流动相稀释并定容。在上述同样条件下进样20μl至色谱柱。测定经加热的维生素D峰高〔L〕和维生素D前身的峰高〔M〕计算:$$ CF=[(5K/4)-L]/M
    F 样品制备
        
    F.a 树脂
        猛击容器的外壁以破碎样品,取容器较下部分的大块样品,准确称量约0.8g〔含有维生素D约20 000 000IU〕至100ml烧瓶中,〔注意:切勿使树脂样品粉化〕,使之溶于甲苯中,并用甲苯稀释定容。从中吸取5ml至100ml容量瓶中,加甲苯15ml,并用流动相稀释定容。〔浓度=10000IU或0.25mg维生素D/ml〕。
    F.b 油中维生素D
        准确称取一定量的油〔约含有500 000IU的油〕,置于50ml容量瓶中,将其溶于10ml甲苯中,并用流动相稀释定容。
    F.c 干制剂及水悬浮剂
        准确称取一定量样品〔含约100 000IU胆化钙醇〕置于皂化瓶中,缓缓振摇下少量分次加入25ml乙醇,5ml抗坏血酸钠溶液(g)和3g KOH溶液[(i)(1)]。在水浴上回流30min并在流水中迅速冷却。借助于两份15ml H2O,10ml乙醇及两份50ml乙醚将溶液移至分液漏斗中。$$剧烈振摇30s,静置至澄清,将水相〔下部〕转移至装有10ml乙醇及50ml正戊烷的第二个分液漏斗中,振摇让其分离。将下部水层转移至第三个分液漏斗中,上部戊烷相转移至第一个分液漏斗中,用两份10ml戊烷洗涤第2个分液漏斗,将洗液加到第一个分液漏斗中。振摇具有50ml戊烷的第3个分液漏斗中的水相,弃去水相,将戊烷相加到第1个分液漏斗中,用3份50ml的3%KOH溶液(i)(2)洗涤合并的戊烷提取液,剧烈振摇,然后每次用50ml H2O多次洗涤至溶液对酚酞呈中性。排去最后几滴水,加2张9cm的滤纸剪成条形放置漏斗中并振摇,将洗涤过的戊烷提取液移至圆底烧瓶中,用戊烷洗分液漏斗及滤纸。$$在小于等于40℃水浴抽真空旋转蒸发溶液至干,在流水下冷却,通氮气恢复常压,立即用甲苯2ml溶解残渣,并转移至10ml棕色容量瓶中。每次用1ml流动相洗涤并稀释定容。
    G 测定
        吸取维生素D标准溶液(e)4ml至25ml容量瓶中。加入1ml甲苯并用流动相稀释至刻度,贮存于冰浴中。经进样阀向色谱柱注入20μl样品并调整检测器操作条件使之标尺上得到的峰高最大。重复进样并计算平均峰高〔=K〕。$$吸取维生素D标准溶液(e)5ml至25ml容量瓶中,加几粒丁基化羟甲苯晶体。通氮气置换空气,连接回流冷凝器。在暗处且通氮条件下于90℃水浴上加热,然后冷却。用流动相稀释并定容。在上述同样条件下进样20μl至色谱柱。测定经加热的维生素D峰高〔L〕和维生素D前身的峰高〔M〕计算:$$ CF=[(5K/4)-L]/M
    H 计算
        将标准重复进样及样品平行进样所得的峰高值平均。维生素DIU/g=([P^^D^^+(P^^p^^×CF)]/P^^R^^)(W'/W)(V/V')×40 000。式中P^^D^^、P^^p^^及P^^R^^分别为样品中维生素D,样品中维生素D前身及标准溶液维生素D的峰高;CF=维生素D前身/维生素D的校正因子;W'=标准重量(mg);W=样品重量(g);V=样品溶液总毫升数;V'=标准溶液总毫升数〔=25×(50/4)〕;40,000=IU维生素D/mgUSP参考标准。
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