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复合维生素制剂中的维生素D
维生素和其它营养物
- 液相色谱法
- 〔适用于每克复合维生素制剂中含维生素D大于等于200IU〕
A 原理
制剂经皂化提取，加入内标〔△4，6-胆甾二烯醇〕，用RP-8净化柱将维生素D及异构体并包括内标以一个组合与干扰物质分离。用柱将维生素D，维生素D前身及内标从杂质中分离出来。采用转换因数将维生素D前身按维生素D计。维生素D是维生素D与维生素D前身的总和。
B 仪器
B.a 液相色谱仪
具有254nm紫外检测器与二根柱子：净化柱和分析柱。
B.b 净化柱
不锈钢柱，300×4.6〔内径〕mm，用粒度为10μm的RP-8填充，通过系统适应性试验。典型操作条件：纸速1cm/min；洗脱液流速1.4ml/min〔约50atm〕；检测器灵敏度0.32AUFS；温度：室温；进样阀容积：500μl；溶剂系统：CH3CN-MeOH-H2O(50+50+2)。
B.c 分析柱
不锈钢柱，250×4.6〔内径〕mm。用粒度为5μm的Partisil-5柱充填，通过系统适应性试验，用泵使流动相通过100cm×4mm不锈钢柱，其内装有50－250μm硅胶，该硅胶装柱前于250℃干燥4h，典型操作条件：纸速1cm/min；洗脱液流量2.6ml/min〔约100atm〕；检测器灵敏度0.016AUFS；温度：室温；进样阀容积200μl；溶剂系统：正已烷含有0.35%(v/v)正戊醇。
C 试剂
C.a 正已烷
C.b 乙醚
不含酸及过氧化物。
C.c 维生素D标准溶液
参比标准麦角钙化醇〔如样品标明含维生素D2〕或胆钙化醇〔如标明含维生素D或D3〕。准确称取维生素D标准品约50mg置于100ml棕色容量瓶中，不加热以甲苯溶解并稀释定容，取10ml该溶液用甲苯稀释至100ml。每日新鲜制备。
C.d 内标溶液
准确称取△4，6-胆甾二烯醇约15mg置于200ml容量瓶中，用甲苯-流动相(10+190)稀释并定容。
C.e 系统适应性标准溶液
制备每克溶液含2mg维生素D3及0.2mg反式维生素D3的植物油溶液。反式维生素D3及维生素D3前身应具有大致相同的峰高。必要时可在90℃将油溶液加热约45min，增加维生素D3前身的含量。于5℃贮存该溶液。
C.f 抗氧剂溶液
10mg BHT/ml正已烷。
C.g 流动相
正已烷-正戊醇(997+3)
D 净化柱的系统适应性试验
吸取5ml维生素D3标准溶液置于50ml棕色容量瓶中，加入2－3粒BHT结晶，通氮气置换空气。通氮气并在弱光下于90℃水浴上回流加热45min，以形成维生素D3前身，冷却，加入内标溶液10ml，在小于等于40℃水浴上减压旋转蒸干，在流水中冷却，通氮气使回复至大气压。立即于10ml CH3CN-MeOH (1+1)中溶解残留物，并取500μl作色谱分离。色谱图中维生素D3、维生素D3前身与内标物不应分开，保留时间值约为7min。为达到这种情况，必要时，可调整流动相中H2O含量。
E 分析柱的系统适应性试验
将0.1g系统适应性标准溶液溶解于100ml甲苯-流动相(5+95)中，取200μl样品作色谱分析。测定维生素D3前身及反式维生素D3间的峰分辨率如：R＝2D/(B+C)；D＝两峰顶间的距离；B＝维生素D3前身的峰宽，C＝反式维生素D3峰宽，如两者分辩率R大于等于1.0，则分析柱性能满意。
F 校正
F.a 维生素D3响应因子测定
吸取4ml维生素D3标准溶液及10ml内标准溶液置于100ml容量瓶中，用流动相稀释并定容，于0℃贮存此工作溶液，向分析柱注入200μl样品，测定维生素D3及内标的峰高并计算维生素D的响应因子。$$F^^D^^＝(P^^ir^^×W^^r^^×V^^ir^^)/(P^^r^^×W^^ir^^×V^^r^^)$$此处F^^D^^＝维生素D3的响应因子；P^^ir^^＝标准工作溶液中内标的峰高；P^^r^^＝标准工作溶液中维生素D3的峰高；W^^ir^^＝称取内标的重量mg；W^^r^^＝称取维生素D3 标准的重量mg；V^^ir^^＝标准工作液中内标溶液的最终毫升数〔＝2000ml〕；V^^r^^＝工作溶液中维生素D3溶液的最终毫升数〔＝25000ml〕
F.b 维生素D3前身的响应因子的测定
吸取5ml维生素D3标准溶液置于100ml棕色容量瓶中，加入2－3粒BHT结晶，通氮气置换空气并在弱光下于90℃水浴上回流加热45min。冷却，加入10.0ml内标溶液并以流动相稀释并定容，向分析柱注入此已加热的标准工作溶液200μl；测定维生素D3、维生素D3前身及内标的峰高。$$计算未加热溶液中维生素D3百分含量＝q%$$＝(F^^D^^×P^^D^^×V^^r^^×W^^ir^^×100)/(P^^ir^^×V^^ir^^×W^^ir^^)$$维生素D3前身的含量＝P%＝100－q%$$维生素D3前身的响应因子：F^^pre^^＝(P%×P^^ir^^×V^^ir^^×W^^r^^)/(100×P^^pre^^×V^^pre^^×W^^ir^^$$式中F^^D^^、W^^r^^及W^^ir^^同(a)中给出的定义；F^^pre^^＝维生素D3前身的响应因子；P^^D^^＝加热溶液中维生素D3的峰高；P^^pre^^＝加热溶液中维生素D3前身的峰高；P^^ir^^＝加热溶液中内标液的峰高；V^^r^^＝加热溶液中维生素D3的最终毫升数〔＝20 000〕；V^^ir^^＝加热溶液中内标液的最后毫升数〔＝2000〕；V^^pre^^＝V^^r^^＝加热溶液中维生素D3前身的最终毫升数〔＝20，000〕。
F.c 维生素D3前身至维生素D3转换因子的测定
计算F＝F^^pre^^/F^^D^^，从不同日期的两次测定结果计算。
G 样品的制备
G.a 不皂化物质从油中的分离
准确称取一定量样品〔大于等于0.5g精确到0.1%〕最好含有约5000IU胆钙化醇置于皂化瓶中。加入1ml 20%抗坏血酸钠水溶液25ml乙醇和2ml 50% (w/w)KOH水溶液。在水浴上回流30min，在流水中迅速冷却。用2份15ml水、10ml乙醇，2份50ml乙醚将液体转移至分液漏斗中，剧烈振摇30s后，放置直到两层分开。将水相转移至第2个分液漏斗中，用10ml乙醇与50ml戊烷混合液振摇，让其分层。将水层转移至第3个分液漏斗中。并将戊烷层转移至第一个分液漏斗中用2份10ml戊烷洗涤第2个分液漏斗，洗涤液并入第一个分液漏斗中。用50ml戊烷振摇水相，将戊烷并入第一个分液漏斗中。用3份50ml新鲜制备的3%(w/v)KOH乙醇溶液剧烈振摇洗涤合并的戊烷提取液，然后每次用50ml水洗至最后洗液对酚酞呈中性。排出最后的几滴水，将2张9cm滤纸剪成条形加至分液漏斗中，并振摇。$$洗过的戊烷提取液移至圆底烧瓶中，用戊烷洗涤分液漏斗和滤纸，加入5.0ml内标液和100μl抗氧剂溶液，在小于等于40℃水浴上真空旋转蒸发至干。在流水下冷却。通氮气恢复常压，立即用5ml CH3CN-MeOH(1+1)溶解残留物，用此溶液作为进样用的工作样品溶液。维生素D浓度约1 000IU/ml。
G.b 干制剂及水悬浮溶液中不皂化物质的分离
准确称取一定量样品〔大于等于0.5g精确到0.1%〕最好含有约5000IU胆钙化醇置于皂化瓶中。加入1ml 20%抗坏血酸钠水溶液25ml乙醇和2ml 50% (w/w)KOH水溶液。在水浴上回流30min，在流水中迅速冷却。用2份15ml水、10ml乙醇，2份50ml乙醚将液体转移至分液漏斗中，剧烈振摇30s后，放置直到两层分开。将水相转移至第2个分液漏斗中，用10ml乙醇与50ml戊烷混合液振摇，让其分层。将水层转移至第3个分液漏斗中。并将戊烷层转移至第一个分液漏斗中用2份10ml戊烷洗涤第2个分液漏斗，洗涤液并入第一个分液漏斗中。用50ml戊烷振摇水相，将戊烷并入第一个分液漏斗中。用3份50ml新鲜制备的3%(w/v)KOH乙醇溶液剧烈振摇洗涤合并的戊烷提取液，然后每次用50ml水洗至最后洗液对酚酞呈中性。排出最后的几滴水，将2张9cm滤纸剪成条形加至分液漏斗中，并振摇。$$洗过的戊烷提取液移至圆底烧瓶中，用戊烷洗涤分液漏斗和滤纸，加入5.0ml内标液和100μl抗氧剂溶液，在小于等于40℃水浴上真空旋转蒸发至干。在流水下冷却。通氮气恢复常压，立即用5ml CH3CN-MeOH(1+1)溶解残留物，用此溶液作为进样用的工作样品溶液。维生素D浓度约1 000IU/ml。
H 测定
H.a 净化
经过进样阀注样500μl工作样品溶液至净化柱，并调整检测器操作条件使得到的维生素D3峰尽可能最大，收集具有保留时间5－9min、相应于维生素D3峰的组分置于10ml容量瓶中，加入50μl抗氧剂溶液，在小于等于40℃水浴上，真空旋转蒸发至干，流水下冷却，通氮气恢复常压。立刻用5ml甲苯-流动相(5+95)溶解残留物。用此溶液注入分析柱。
H.b 测定
通过进样阀注入200μl溶液(a)至分析柱，调整检测器操作条件，使标尺上维生素D3的峰达最大值，测量维生素D3，维生素D3前身及内标的峰高。
H.c 计算
维生素D效价(IU/g样品〕＝[P^^D^^+(P^^pre^^×F)]×F^^D^^×W^^ir^^×V^^s^^×40 000/(P^^ir^^×W^^s^^×V^^ir^^)$$式中：P^^ir^^＝样品溶液中内标的峰高；P^^D^^＝样品溶液中维生素D的峰高；P^^pre^^＝样品溶液中维生素D前身的峰高；F＝转换因子；F^^D^^＝维生素D3的响应因子；W^^ir^^＝内标重量，mg；W^^s^^＝样品重量，g；V^^s^^＝样品溶液最后毫升数〔＝50ml〕；V^^ir^^＝内标溶液最后毫升数〔＝2 000ml〕；40 000＝维生素DIU/USP参考标准mg。
