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    强化牛奶和奶粉中维生素D

    维生素和其它营养物

    液相色谱法
        〔应用于液体牛奶和奶粉含维生素D大于等于1IU/g〕
    A 原理
        样品经皂化和提取,维生素D及异构体在净化柱上与干扰物分离。第二根柱子将维生素D与杂质分离,由于在皂化过程中生成一定量的维生素D前身,所以维生素D的含量需校正。维生素D是维生素D和维生素D前身之总和。
    B 仪器
        
    B.a 液相色谱仪
        具有254nm波长紫外检测器及2根柱子:净化柱与分析柱。
    B.b 净化柱
        不锈钢250×4.6〔内径〕mm,用粒度为10μm Sil-60D-10CN填装,典型操作条件为纸速:1cm/min;洗脱液流量:1ml/min;检测器灵敏度:0.128AUFS;温度:室温;阀进样容积200μl;流动相为含0.35%正戊醇的正已烷。
    B.c 分析柱
        不锈钢,250×4.6〔内径〕mm。充填粒度为5μm,通过系统适应性试验。典型操作条件:纸速1cm/min;洗脱液流量2.5ml/min;检测器灵敏度0.008AUFS;温度:室温;阀进样容积500μl;流动相为含0.35%正戊醇的正已烷液。
    C 试剂
        
    C.a 正已烷
        
    C.b 抗氧剂溶液
        0.1%丁基化羟基甲苯〔BHT〕的正已烷溶液。
    C.c 维生素D标准溶液
        参比标准麦角钙化醇〔如样品标明维生素D2〕或胆钙化醇〔如标明含维生素D或D3〕。精确称取维生素D标准约12.5mg置于100ml棕色容量瓶中,不加热以甲苯溶解并定容。将此液10ml用流动相稀释至100ml,将此液25ml用甲苯-流动相(5+95)稀释至100ml,作为维生素D标准(3.125μg/ml,125IU/ml〕。每日新鲜制备。
    C.d 系统适应性标准溶液
        制备每克植物油中含维生素D3 2mg及反式维生素D3 0.2mg的溶液。反式维生素D3及维生素D3前身的峰必须具有同样的峰高。必要时,于90℃温热油溶液45min以增加维生素D3前身的含量。于5℃贮存溶液。
    D 分析柱的系统适应性试验
        将0.1g系统适应性标准溶液溶解于100ml甲苯-流动相(5+95)中。从中取200μl作色谱检查。测定维生素D3前身与反式维生素D3两峰的分辨率:R=2D/(B+C);式中,D=维生素D3前身与反式维生素D3最大峰之间的距离;B=维生素D3前身的峰宽;C=反式维生素D3的峰宽;若R大于等于1.0则柱子性能满意。
    E 校正
        通过进样阀向净化柱注入200μl维生素D标准溶液,并按“测定”项中测定维生素D在分析柱及净化柱上的保留时间及维生素D在分析柱上的峰高。维生素D在净化柱上的保留时间应在10-20min之间;必要时,可调整流动相中戊醇含量以达到上述情况。
    F 样品制备
        
    F.a 不皂化物从粉剂中分离
        精确称取约50g奶粉置于皂化瓶中。加入100ml乙醇,25%的抗坏血酸钠溶液及25ml(w/w)KOH水溶液,在蒸气浴上回流45min,在流水下迅速冷却,用两份75ml水,两份25ml乙醇和两份100ml乙醚将液体转移至分液漏斗中。剧烈振摇30s,静置至两层澄清。将水相转移到第二个分液漏斗中,用25ml乙醇和10ml戊烷的混合液振摇。让其分层,将水相转移至第三个分液漏斗中,戊烷相移至第一个分液漏斗中,用两份10ml戊烷洗涤第二个分液漏斗,洗脱液并入第一个分液漏斗中,水相用100ml戊烷与25ml乙醇混合液振摇,戊烷相加到第一个分液漏斗中,用三份100ml新制备的3%KOH的10%乙醇溶液洗涤合并的戊烷提取液,剧烈振摇,然后每次用100ml水洗涤至洗液对酚酞呈中性。排尽最后几滴水,将4张9cm的滤纸剪成的纸条加至分液漏斗中并振摇。$$转移干燥了的戊烷提取液至500ml圆底烧瓶中,用戊烷洗涤分液漏斗及滤纸,加入1ml抗氧剂溶液在小于等于40℃水浴上真空旋转蒸发至干,在流水下冷却,通氮气恢复常压,立即用2.0ml甲苯-流动相(5+95)溶解残留物。$$转移提取物至10ml圆底烧瓶中,用戊烷洗涤500ml圆底烧瓶。室温通氮气蒸发,立即用2ml甲苯-流动相(5+95)溶解残留物。用此液作为样品工作溶液以备注样。
    F.b 不皂化物从液体牛奶中分离
        精确称取约50g奶粉置于皂化瓶中。加入100ml乙醇,25%的抗坏血酸钠溶液及25ml(w/w)KOH水溶液,在蒸气浴上回流45min,在流水下迅速冷却,用两份75ml水,两份25ml乙醇和两份100ml乙醚将液体转移至分液漏斗中。剧烈振摇30s,静置至两层澄清。将水相转移到第二个分液漏斗中,用25ml乙醇和10ml戊烷的混合液振摇。让其分层,将水相转移至第三个分液漏斗中,戊烷相移至第一个分液漏斗中,用两份10ml戊烷洗涤第二个分液漏斗,洗脱液并入第一个分液漏斗中,水相用100ml戊烷与25ml乙醇混合液振摇,戊烷相加到第一个分液漏斗中,用三份100ml新制备的3%KOH的10%乙醇溶液洗涤合并的戊烷提取液,剧烈振摇,然后每次用100ml水洗涤至洗液对酚酞呈中性。排尽最后几滴水,将4张9cm的滤纸剪成的纸条加至分液漏斗中并振摇。$$转移干燥了的戊烷提取液至500ml圆底烧瓶中,用戊烷洗涤分液漏斗及滤纸,加入1ml抗氧剂溶液在小于等于40℃水浴上真空旋转蒸发至干,在流水下冷却,通氮气恢复常压,立即用2.0ml甲苯-流动相(5+95)溶解残留物。$$转移提取物至10ml圆底烧瓶中,用戊烷洗涤500ml圆底烧瓶。室温通氮气蒸发,立即用2ml甲苯-流动相(5+95)溶解残留物。用此液作为样品工作溶液以备注样。
    G 测定
        
    G.a 净化
        经进样阀向净化柱注入200μl工作样品溶液,调节检测器操作条件,以使维生素D在记录纸上的峰尽可能最大,收集维生素D峰前及峰后各2min之间的组分至10ml容量瓶中。加入1ml抗氧剂溶液并在氮气流下蒸干,立即用2ml甲苯-正已烷(5+95)溶解残留物,向分析柱注入此溶液。$$注:如需净化柱的再生,可用戊醇-正已烷(10+90)洗涤,流量为6ml/min,直至检测器响应回到零〔约15min〕。移动相的开关设到含0.35%戊醇的已烷流动相。净化柱可重新使用。
    G.b 分析
        经进样阀向分析柱注入500μl溶液(a),调整检测器操作条件,使维生素D在记录纸上的峰尽可能最大。重复进样品及标准液以验证响应保持恒定。测量样品及外标溶液中维生素D的峰高。
    G.c 计算
        维生素D效价IU/g=(1.25×P×W'×V×40000)/(P'×W×V')。式中,1.25=在皂化回流中生成的维生素D前身的校正因子。P及P'分别为样品中和参比标准中维生素D的峰高;W及W'分别为样品克数及参比标准品毫克数;V及V'分别为样品溶液总毫升数及参比标准溶液总毫升数;40 000=维生素D IU/参比标准mg。
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