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混合饲料，预混合物和爱畜食品中的维生素D
维生素和其它营养物
- 液相色谱法
- 〔适用于含维生素D<200IU和>2IU的制品。对于每克含维生素D大于等于200IU的制品，采用24-18方法〕
A 原理
样品经皂化提取，不皂化物连续在氧化铝柱上进行色谱分离，以除去可能存在的生育酚和胡萝卜素类，并在LC净化柱上分离干扰物质。第二根LC柱充填硅胶，将维生素D同杂质分离开。在皂化过程中生成一定量的维生素D前身，所以维生素D需校正。维生素D是维生素D与维生素D前身之总和。
B 试剂
B.a 溶剂
CH3OH、乙醇、CH3CN、甲苯、不含过氧化物和酸的乙醚、正已烷〔色谱纯〕。正已烷通过60×8cm〔直径〕内充填有500g经150℃干燥4h，粒度为50－250μm硅胶的柱子，干燥。
B.b 抗坏血酸钠溶液
将3.5g抗坏血酸溶解于20ml 1N NaOH中。
B.c 抗氧剂溶液
1mg丁基羟甲基〔BHT〕/ml已烷。
B.d 石油醚
于粒状KOH上回流，收集40℃至60℃馏分。
B.e 醚
石油醚洗脱液。(8+92)和(40+60)。
B.f 氧化铝
中性。
B.g 流动相〔用于净化柱〕
CH3CH-CH3OH-H2O(50+50+5)
B.h 流动相〔分析柱用〕
正已烷含0.35%(v/v)正戊醇溶液。
B.i 维生素D标准溶液
麦角钙化醇参比标准。〔如样品标明含维生素D2〕或胆钙化醇〔如标明含维生素D或D3〕。精确称取维生素D标准约12.5mg(W')置于100ml棕色容量瓶中，不加热溶于甲苯中，用甲苯稀释并定容〔125μg/ml，溶液A〕，将10ml溶液A用流动相(h)稀释至100ml，将此液10ml用甲苯-流动相(h)(5+95)稀释至100ml作为维生素D标准〔溶液B〕〔1.25μg/ml，50IU/ml〕；又将A液10ml用流动相(g)稀释至100ml，稀释此液20ml用流动相(g)至100ml〔2.5μg/ml，溶液C〕。
B.j 系统适应性标准溶液
采用维生素D测定系统适应性参比标准，或制备每克植物油含2mg维生素D3及0.2mg反式维生素D3的溶液。反式-维生素D及维生素D前身应具有大致相同的峰高。必要时在90℃温热油溶液45min，以增加维生素D前身的含量。
C 氧化铝柱
熔封一个粗孔烧结玻璃片于150×20mm〔内径〕玻璃管下端，上端接250ml的球管。在下端收缩部分，配接一个聚四氟乙烯活塞。$$在750℃将250g氧化铝加热过夜，冷却，于真空干燥器中贮存。称取30g干燥氧化铝置于100ml锥形瓶中，移取2.7ml水至瓶中，塞上塞子。在蒸汽浴上加热5min，剧烈摇动温热的瓶子直至粉末自由流动。冷却并静置30min。$$向脱活的氧化铝中加入40ml石油醚，旋摇并用石油醚将其转移至色谱管中。让填充物沉降。整个分析过程中保持柱顶部液体高于填充物0.5cm以上〔氧化铝柱仅能用一次〕。
D 液相色谱法
D.a 液相色谱仪
具有254nm紫外检测器与2根柱子：净化柱和分析柱。
D.b 净化柱
不锈钢材质，250×4.6mm〔内径〕，充填粒度为10μm的Li-Chrosorb RP-18。典型操作条件为纸速：1cm/min；洗脱液流量：1.4ml/min；检测器灵敏度：0.08AUFS；温度：室温；进样阀容积500μl；溶剂系统，CH3CN-CH3OH-H2O(50+50+5)。
D.c 分析柱
不锈钢，250×4.6mm〔内径〕，充填粒度为5μm的Partisil，通过系统适应性试验：典型操作条件为纸速：1cm/min；洗脱液流速2.6ml/min；检测器灵敏度：0.008AUFS；温度：室温；进样阀容积：200μl；溶剂系统：含0.35%(v/v)正戊醇的正已烷。
E 分析柱的系统适用性试验
将0.1g系统适用性标准溶液溶解于100ml甲苯-流动相(5+95)中，注入200μl，检测维生素D前身与反式-维生素D3间峰的分辨率；R＝2D/(B+C)；式中，D＝维生素D3前身与反式-维生素D3最高峰间的距离；B＝维生素D3前身的峰宽，C＝反式维生素D3的峰宽，如R大于等于1.0，分析柱性能满意。
F 校正
经进样阀向净化柱注入500μl维生素D标准溶液及向分析柱注入200μl溶液B，调整检测器操作条件使维生素D峰尽可能最大。测定维生素D在净化柱及分析柱上的保留时间以及其在分析柱上的峰高。维生素D在净化柱上的保留时间应在15至25min之间，必要时可调整流动相中水含量，以达到上述情况。维生素D在分析柱上的保留时间应在15至25min之间，必要时可调整流动相中戊醇含量以达到上述要求。
G 样品制备
G.1 不皂化物从粉剂中分离
精确称取约25g粉状样品〔粒度最好小于1mm〕置于皂化瓶中，加入80ml乙醇，2ml抗坏血酸钠溶液，一小撮Na2EDTA，及10ml 50%KOH水溶液。在蒸汽浴上通氮气用电磁搅拌器搅拌回流30min。冷却且用5份60ml乙醚于皂化瓶中提取，每次倾出乙醚层，转移至1L盛有100ml水的分液漏斗中，振摇分液漏斗〔A〕中醚层，放置分层后。将水相转移至500ml分液漏斗〔B〕中，作60ml乙醚提取水相且将乙醚层转移至分液漏斗〔A〕中。用100ml 0.5N KOH溶液洗涤合并的乙醚提取液，随后每次用100ml水洗涤直至最后洗涤液对酚酞呈中性。加入150ml石油醚，待半小时后，分出最后几滴水，将2张9cm滤纸剪成条加入分液漏斗中，振摇，加1mg BHT且转移到圆底烧瓶中，用石油醚洗涤分液漏斗及滤纸。$$在40℃水浴上通氮气旋转蒸发溶液〔旋转蒸发器〕，立刻用5ml已烷溶解残留物。
H 氧化铝柱色谱法
用3份10ml已烷将样品溶液转移至氧化铝柱。弃去洗脱液〔含类胡萝卜素〕，用7份10ml乙醚-已烷(8+92)洗脱氧化铝柱并弃去洗脱液〔含生育酚及乙氧基喹〕。$$用7份10ml的乙醚-已烷(40+60)洗脱氧化铝柱子，弃去开始的20－25ml洗脱液，当维生素A的荧光谱带距色谱柱底部3cm时，收集其余的洗脱液至圆底烧瓶中。〔含维生素A及D〕。用手提式紫外灯在紫外光(360nm)下检测色谱柱<1s，以检验维生素A的洗脱。在40℃水浴氮气流下旋转蒸发溶液〔旋转蒸发器〕。转移至离心管，用2－3ml乙醚洗涤烧瓶蒸去乙醚，乘热用1.0ml CH3OH溶解残留物。加入1.0ml CH3CN，冷却，离心，用上层清液注入净化柱。
I 测定
I.a 净化
经进样阀向净化柱注入500μl样品溶液，并调整检测器操作条件以给出尽可能最大的维生素D峰。收集维生素D峰出现前后各3min的组分至10ml容量瓶中，加入1ml抗氧剂溶液在氮气流下蒸发至干。立即用2.0ml甲苯-流动相(5+95)溶解残留物。向分析柱注入此溶液。
I.b 分析
经进样阀向分析柱注入200μl溶液(a)，调整检测器操作条件,以给出尽可能最大的维生素D峰。测量维生素D峰高。采用相同的操作条件注入标准溶液B，测量维生素D峰高。
I.c 计算
每克样品中维生素D效价IU/g＝(1.25×D×W'×V×40000)/(P'×W×V')$$式中P＝样品溶液中维生素D峰高；1.25＝在回流皂化过程中形成维生素D前身的校正因子；P'＝参比溶液中维生素D的峰高；W＝所称取样品克数；W'＝参比标准毫克数；V＝样品溶液总毫升数；V'＝参考标准溶液总毫升数；40000＝维生素DIU/mgUSP参比标准。
