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食品和饲料中α-生育酚及α-生育酚醋酸酯
维生素和其它营养物
- 比色法
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A 原理
B 仪器
B.a 分光光度比色计
具有匹配的13mm比色管。
B.b 分光光度计
具有白炽光源和匹配的比色池(1cm光程：4.5或1.6ml容量)，〔如果比色池架不能提高使较大部分比色池中的溶液位于光路中，可在比色池架底部加垫小塞子，一般约1cm〕。
B.c 提取器
热乙醇提取装置。
B.d 色谱图板
X6062型用于维生素E分析的不带荧光指示剂的氧化铝吸附剂。如果必须活化，则在空气烘箱中，于105℃加热30min。
B.e 移液管
超微量移液管，50μl容量。
B.f 展开槽。
B.g 喷雾器
气雾剂推进器。
B.h 玻璃瓶
玻璃材质，2ml容量，带有惰性衬垫〔例如聚乙烯或尼龙盖〕和25ml〔7-英钱〕带聚乙烯塞子。
B.i 紫外灯
具有366nm波长〔长波〕或254nm波长〔短波〕。
B.j 色谱管
18〔内径〕×270mm。
C 试剂
C.a 石油醚
C.a.1 提纯
沸程35－60℃。于颗粒KOH及锌粒或锌粉上重蒸馏，弃去最初的5%馏分和最终5%馏分。
C.a.2 高沸物
沸程60－71℃。
C.b 乙醇
无水。如有明显的还原性物质，则和Al及KOH重蒸馏。
C.c 石油醚-无水乙醇混合物
将600ml石油醚(a)(2)用无水乙醇稀释至1L。
C.d RRR-α-生育酚
用无水乙醇制备1mg/ml标准溶液，于5℃贮存。
C.e 2'，7'-二氯荧光黄溶液
将4mg此染料溶解在100ml无水乙醇中。
C.f 无水乙醚
于颗粒KOH及铝粒或铝粉上重蒸馏，弃去最初及最终的5%馏分。
C.g 红菲绕啉溶液
0.003M。将100mg4.7-二苯基-1，10-菲绕啉，溶解于100ml无水乙醇中。贮存于棕色或不透明的玻璃容器中，5℃贮存。每3周制备新鲜溶液。
C.h 三氯化铁溶液
0.002M。将55mg FeCl3·6H2O溶于100ml无水乙醇中，贮于棕色或不透明的玻璃容器中，于5℃贮存。
C.i 正磷酸
0.172M。将1.1ml 86%H3PO4用无水乙醇稀释至100ml。
C.j 无水硫酸钠
粒状或粉状。
C.k 浓氢氧化钾溶液
将80gKOH溶解在50ml H2O中。
C.l 酚酞溶液
将1g酚酞溶解在100ml无水乙醇中。
C.m 异丙醚。
C.n 水饱和的正丁醇
800ml正丁醇与160ml H2O混合。
C.o 抗坏血酸。
C.p 环已烷。
C.q 漂白土
60－100目。
C.r 硫酸铈处理的漂白土
4.8g Ce(HSO4)4中加入0.5ml H2SO4与约5ml H2O的混合液，搅拌，用H2O稀释至100ml。在热水浴中加热并摇动直至全部Ce(HSO4)4几乎全部溶解。冷却至约35－40℃迅速使用〔室温放置时Ce(HSO4)4将会沉淀〕。将200g漂白土散布在一个大且上釉的瓷盘中，将100ml Ce(HSO4)4溶液分散在漂白土上。缓缓而彻底地搅拌。于60℃烘箱中干燥48h，贮于具有紧密盖子的瓶中。
C.s 硅藻土
惰性助滤剂。
C.t 苯
不需再提纯的纯度相当的产品。
C.u 橄榄油
USP级，含1.5mg总还原性物质/g或等质量的油。
D 样品的制备与提取
[用于测定天然的α-生育酚，总α-生育酚〔天然的α-生育酚+添加的α-生育酚醋酸酯〕，或添加的α-生育酚醋酸酯]。$$10g样品是适合多数食品及饲料的，采用40g样品是对于添加了高效制备的低水平(1IU/100g)的食品和干饲料。取样最小量是1g，其含有0.1IU的总α-生育酚或添加的α-生育酚醋酸酯。如果用同一原始样品分析这两个组分，则对每种组分的最小量是0.2IU。
D.a 脂肪或油
D.b 牛奶和乳制品
D.c 湿制品
〔适用于诸如混合物。饲料浓缩物及添加或不添加α-生育酚醋酸盐的饲料制品，无论是干的载体或是直接加入制品中，但不适用于明胶，植物胶或精混合物〕。如存在粗颗粒，则研磨样品。将精确称取的样品放入索氏提取器的格利特套管中。将100ml无水乙醇及沸石置于烧瓶中，即可标出液面也可将烧瓶及内容物称重。组装热乙醇提取装置，连接冷凝器，在蒸汽浴上提取16h〔过夜〕。〔用提取器，抽提4h〕。塞好烧瓶，冷却提取液至室温，必要时加入无水乙醇使恢复至原体积。$$将提取液转移至分液漏斗中，用100ml H2O洗涤烧瓶，随后用50ml石油醚(a)(2)及约0.5g粒状无水Na2SO4洗涤烧瓶。将洗涤液加入到分液漏斗中，振摇分液漏斗10min，让其分层后，排出并弃去水层。将石油醚提取液稀释至50ml，取一份10ml样品，蒸干溶剂并称量油脂重量。继续按照(b)进行操作。
D.d 干制品
准确量取60ml牛奶或重制奶粉或浓缩奶制品，加入等体积无水乙醇，振摇混匀。加入150ml乙醚，振摇30s，加入150ml石油醚，(a)(1)，并振摇30s，让其分层，移去醚层。每次用25ml无水乙醇，100ml乙醚及100ml石油醚重复提取2次或更多次。合并醚层蒸发至50ml。取一份10ml试样蒸去溶剂，并称量油脂物。将其余的40ml或一定量含有约1g油脂物及大于等于0.1IU维生素E的试样转移至125ml圆底烧瓶中。于蒸汽浴上通氮蒸去溶剂。立即按E进行皂化，以测定总的生育酚，按24-25B测定添加的醋酸生育酚。
D.e 添加有α-生育酚醋酸酯的明胶，植物胶或糊精基质的干制品
D.f 在膨化加工或烘烤前添加的膨化狗食品及烘烤的狗饼干
〔适用于诸如混合物。饲料浓缩物及添加或不添加α-生育酚醋酸盐的饲料制品，无论是干的载体或是直接加入制品中，但不适用于明胶，植物胶或精混合物〕。如存在粗颗粒，则研磨样品。将精确称取的样品放入索氏提取器的格利特套管中。将100ml无水乙醇及沸石置于烧瓶中，即可标出液面也可将烧瓶及内容物称重。组装热乙醇提取装置，连接冷凝器，在蒸汽浴上提取16h〔过夜〕。〔用提取器，抽提4h〕。塞好烧瓶，冷却提取液至室温，必要时加入无水乙醇使恢复至原体积。$$将提取液转移至分液漏斗中，用100ml H2O洗涤烧瓶，随后用50ml石油醚(a)(2)及约0.5g粒状无水Na2SO4洗涤烧瓶。将洗涤液加入到分液漏斗中，振摇分液漏斗10min，让其分层后，排出并弃去水层。将石油醚提取液稀释至50ml，取一份10ml样品，蒸干溶剂并称量油脂重量。继续按照(b)进行操作。
E 皂化和再提取
F 不皂化物及α-生育酚洗脱液的薄层色谱法
在暗处或弱光处作α-生育酚的薄层色谱法
F.a 回收因子的确定
〔方法(a)仅适用于Beckman分光光度计且脂肪含量低的样品。(b)可适用于在比色管中工作体积小于等于6ml的任一分光光度计，样品可以含有相当量的脂肪。〕
F.b 样品的薄层色谱
〔薄层色谱方法对环境湿度敏感〕根据环境相对湿度处理氧化铝板及选择溶剂系统，使得α-生育酚的R^^f^^值为0.5－0.7。$$使用微量移液管，缓慢地定量转移10μl标准溶液〔10μgα-生育酚)至氧化铝板距下端及左侧边2cm处以形成小的斑点。用少量乙醚冲洗微量移液管并加到点上，点样时用氮气吹干点样点。$$立即将薄层板放入展开槽用前述第一相溶剂系统作第一相展开。展开至溶剂前沿至薄层板底移动约15－16cm处。从展开槽取出薄层板，用氮气吹干。将薄层板反时针方向旋转90度，立即放入第二个展开槽，用前述第二相溶剂展开，直至溶剂前沿距底边约15－16cm处为止。$$从展开槽中取出薄层板，吹氮气干燥，轻轻喷上二氯荧光黄乙醇溶液，当薄层板完全干燥〔约5min〕，在紫外光下判明生育酚斑点位置〔注意：过量照射紫外光可以破坏生育酚〕。$$圈出生育酚斑点〔允许安全边缘距斑点约5mm〕并圈出未点样但同样喷过显色剂的薄层板上圈出同样大小的圈点作空白。切出此二斑点分别置于含1.4ml红菲绕啉溶液(g)的25ml小玻瓶中，盖上盖子旋摇，让其静置洗脱15min，按G进行比色测定。$$回收因子(s)＝薄层板上回收的α-生育酚μg/作为样品所取的生育酚μg〔回收因子在同一个实验室内应为常数，其变化范围可以从约75%至85%〕
G α-生育酚的比色法
〔方法(a)仅适用于Beckman分光光度计且脂肪含量低的样品。(b)可适用于在比色管中工作体积小于等于6ml的任一分光光度计，样品可以含有相当量的脂肪。〕
G.a 薄层色谱后的比色法
〔薄层色谱方法对环境湿度敏感〕根据环境相对湿度处理氧化铝板及选择溶剂系统，使得α-生育酚的R^^f^^值为0.5－0.7。$$使用微量移液管，缓慢地定量转移10μl标准溶液〔10μgα-生育酚)至氧化铝板距下端及左侧边2cm处以形成小的斑点。用少量乙醚冲洗微量移液管并加到点上，点样时用氮气吹干点样点。$$立即将薄层板放入展开槽用前述第一相溶剂系统作第一相展开。展开至溶剂前沿至薄层板底移动约15－16cm处。从展开槽取出薄层板，用氮气吹干。将薄层板反时针方向旋转90度，立即放入第二个展开槽，用前述第二相溶剂展开，直至溶剂前沿距底边约15－16cm处为止。$$从展开槽中取出薄层板，吹氮气干燥，轻轻喷上二氯荧光黄乙醇溶液，当薄层板完全干燥〔约5min〕，在紫外光下判明生育酚斑点位置〔注意：过量照射紫外光可以破坏生育酚〕。$$圈出生育酚斑点〔允许安全边缘距斑点约5mm〕并圈出未点样但同样喷过显色剂的薄层板上圈出同样大小的圈点作空白。切出此二斑点分别置于含1.4ml红菲绕啉溶液(g)的25ml小玻瓶中，盖上盖子旋摇，让其静置洗脱15min，按G进行比色测定。$$回收因子(s)＝薄层板上回收的α-生育酚μg/作为样品所取的生育酚μg〔回收因子在同一个实验室内应为常数，其变化范围可以从约75%至85%〕
G.b α-生育酚或总的还原物的比色法
选择匹配的比色管装入60ml石油醚(a)(2)-无水乙醇(3+2)整个比色过程中保持恒定的弱光条件。
G.b.1 校正曲线
准确将含5μg纯α-生育酚4ml石油醚(a)(2)-无水乙醇(3+2)，置于25ml小玻瓶中。准确加入1.0ml红菲绕啉溶液，旋摇。准确滴加0.5ml FeCl3溶液并旋摇。在加完最后一滴FeCl3溶液后的正15s时，准确加入0.5ml H3PO4溶液，并旋摇，3min后显色，形成的颜色稳定90min。$$将溶液转移至匹配的比色管中，在分光光度计上于534nm处，以同样的方法制备的不加α-生育酚的试剂空白对照测定A值。$$用5－50μgα-生育酚重复步骤5次。以A对α-生育酚μg/6ml在线性坐标纸上作图。通过原点及6个点作出最合适的平滑曲线。每天检查校正曲线。当用新的试剂溶液时需绘制新的曲线。
G.b.2 比色测定
准确将含5μg纯α-生育酚4ml石油醚(a)(2)-无水乙醇(3+2)，置于25ml小玻瓶中。准确加入1.0ml红菲绕啉溶液，旋摇。准确滴加0.5ml FeCl3溶液并旋摇。在加完最后一滴FeCl3溶液后的正15s时，准确加入0.5ml H3PO4溶液，并旋摇，3min后显色，形成的颜色稳定90min。$$将溶液转移至匹配的比色管中，在分光光度计上于534nm处，以同样的方法制备的不加α-生育酚的试剂空白对照测定A值。$$用5－50μgα-生育酚重复步骤5次。以A对α-生育酚μg/6ml在线性坐标纸上作图。通过原点及6个点作出最合适的平滑曲线。每天检查校正曲线。当用新的试剂溶液时需绘制新的曲线。
H 计算
H.a 对于薄层色谱
α-生育酚mg/样品＝测得的α-生育酚μg×(1.4/1.0)×(X/Y)×(V/W)×(1/1000)。式中：1.4和1.0分别为所用洗脱液和自洗脱液取出的红菲绕啉溶液的毫升数；X＝皂化前总的提取液毫升数；Y＝用于皂化的X的毫升数；V＝不皂化提取液的总毫升数；W＝在薄层色谱中用于点样V的毫升数；1/1000＝将μg换算成mg的换算因子。
H.b 总的还原物质
相当于α-生育酚mg/样品＝测得的α-生育酚μg×(x/y)×(d/e)×(1/1000)。式中的符合定义同(a)。d＝不皂化提取液总的毫升数；e＝用于比色测定d的毫升数。
I 国际单位〔IU〕效价的计算
I.a 不含添加α-生育酚醋酸酯的制品
IU/g样品＝〔样品中α-生育酚mg/样品重量以g计〕×1.49。
I.b 添加了RRR-α-生育酚醋酸酯〔天然的〕制品
