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维生素测定
维生素和其它营养物
- 微生物法
- 〔除另有说明外,全部操作过程都应防止溶液暴露于光线下。〕
A 基础培养基贮备液
〔所有溶液在约10℃暗处贮存。除那些含有乙醇的溶液外,所有溶液于甲苯条件下贮存。可制备适当量。〕
A.a 酸水解的酪蛋白溶液
〔注意:见有关蒸馏和真空的安全事项。〕将400g不含维生素的酪蛋白与2L沸腾盐酸〔约5N〕混合而且回流8-12h,或在高压釜中于121-123℃加热8-12h。减压下蒸馏从混合物中除去HCl,直到残留物呈稠糊状。再将稠糊物溶解于水中,用约10%NaOH调节溶液的pH至3.5±0.1,用水稀释至4L。加80g活性炭,搅拌1h,过滤,再用活性炭处理。如果贮存期产生沉淀则过滤溶液。〔一些不含维生素酸水解酪蛋白的市售品是满意的。〕
A.b 腺嘌呤
鸟嘌呤-尿嘧啶溶液-将硫酸腺嘌呤,盐酸鸟嘌呤和尿嘧啶各1.0g溶解在50ml温热盐酸(1+1)中,冷却,用水稀释至1L。
A.c 天冬酰胺溶液
将10g L-天冬酰胺·H2O溶解在水中,并稀释至1L。
A.d 胱氨酸溶液
将2.0g L-胱氨酸悬浮在约750ml水中,加热至约70-80℃,边搅拌边滴加盐酸(1+1),直至固体溶解。冷却且用水稀释至1L。
A.e 胱氨酸-色氨酸溶液
将8.0g L-胱氨酸及2g L-色氨酸〔或4.0g D,L-色氨酸〕溶解在约1.5L水中,加热至70-80℃,边搅拌边滴加盐酸(1+1),直至固体溶解。冷却并用水稀释至2L。
A.f 硫酸锰溶液
将2g MnSO4·H2O溶解在水中并稀释至200ml。
A.g 光解蛋白胨溶液
将100g蛋白胨溶解在625ml水中。加入NaOH溶液(50g)NaOH于625ml水中,在深度为1-2cm的容器〔如结晶皿〕中混合。放一个配有反射器的100-500W灯泡挂在距溶液30-50cm处,偶然搅拌溶液,并暴露在光照下,直至核黄素被破坏〔4-10h足够了〕。在此处理期间维持溶液在小于等于25℃。用醋酸调节溶液pH为6.0-6.5,加入18g无水醋酸钠,搅拌直至固体溶解,用水稀释至2L。如溶液不清则过滤。
A.h 多乙氧基醚80溶液
将25g多乙氧基醚80〔聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸〕溶解在乙醇中,使成250ml。
A.i 盐溶液A
将50g无水KH2PO4和50g无水K2HPO4溶解在水中,稀释至1L,并加入10滴盐酸。
A.j 盐溶液B
将20g MgSO4·7H2O,1gNaCl,1g FeSO4·7H2O及1g MnSO4·H2O溶解在水中,稀释至1L,并加入10滴盐酸。
A.k 色氨酸溶液
将2g L-色氨酸〔或4g D,L-色氨酸〕悬浮于700-800ml水中,加热至70-80℃边搅拌边滴加盐酸(1+1),直至固体溶解。冷却,用水稀释至1L。
A.l 维生素溶液Ⅰ
将25mg核黄素,25mg盐酸硫胺素,0.25mg生物素及50mg烟酸溶解在0.02N醋酸中,配成1L溶液。
A.m 维生素溶液Ⅱ
将50mg对氨基苯甲酸、25mg泛酸钙、100mg盐酸吡哆素、100mg盐酸吡哆醛、20mg盐酸吡哆胺及5mg叶酸于25%乙醇中配成1L溶液。
A.n 维生素溶液Ⅲ
将10mg对氨基苯甲酸,40mg盐酸吡哆素、4mg盐酸硫胺素、8mg泛酸钙、8mg烟酸及0.2mg生物素溶解在约300ml水中。加入10mg核黄素溶解在约200ml 0.02N醋酸中。然后加入约含有1.9g无水醋酸钠及1.6ml醋酸的水溶液40ml,用水稀释至2L。
A.o 维生素溶液Ⅳ
将20mg核黄素、10mg盐酸硫胺素及0.04mg生物素溶解在0.02N 醋酸中,配制成1L溶液。
A.p 维生素溶液Ⅴ
将10mg对氨基苯甲酸,20mg泛酸及40mg盐酸吡哆素溶解在25%乙醇中,配制成1L溶液。
A.q 维生素溶液Ⅵ
将10mg对氨基苯甲酸,50mg烟酸及40mg盐酸吡哆素溶解在25%乙醇中配制成1L溶液。
A.r 黄嘌呤溶液
将1.0g黄嘌呤悬浮在150-200ml水中,加热至约70℃。加入30ml NH4OH(2+3)。搅拌至固体溶解。冷却,用水稀释至1L。
A.s 酵母添加液
将20g水溶性酵母浸出物溶于100ml水中。加入碱式乙酸铅溶液混合,该溶液由30g碱式乙酸铅溶于100ml水中配制成,〔溶液是浑浊的〕。过滤,用NH4OH(1+2)调节滤液pH至10。过滤,用醋酸调节滤液pH至6.5。用H2S沉淀过剩的Pb,过滤,用水稀释滤液至200ml。
B 培养基与悬浮介质
B.a 液体培养基
将15g胨化牛奶,5g水溶性酵母提取物,10g无水葡萄糖及2g无水KH2PO4溶于600ml水中。加入100ml过滤了的番茄汁,用NaOH溶液调节pH至6.5-6.8,边搅拌边加入10ml多乙氧基醚溶液[A(h)],用水稀释至1L,各取10ml溶液分别加至10支试管中,盖上防止污染。在高压釜中于121-123℃灭菌15min。尽快将试管冷却,以减少颜色生成。在约10℃暗处贮存。$$$T表24-3 250ml基础培养基贮备液〔可按比例配制〕$$组成〔贮备溶液A〕/(a)钴胺素〔维生素B12活性〕/(b)叶酸/(c)烟酸及烟酰胺/(d)泛酸/(e)核黄素〔维生素B2〕$$ /ml/ml/ml/ml/ml$$(a)酸水解酪蛋白溶液/25/25/25/25/ $$(b)腺嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶溶液/5/2.5/5/5/ $$(c)天冬酰胺溶液/5/15/ / / $$(d)胱氨酸溶液/ / / / /25$$(e)胱氨酸-色氨酸溶液/ / /25/25/ $$(f)硫酸猛溶液/ /5/ / / $$(g)光解蛋白胨/ / / / /50$$(h)多乙氧基醚80溶液/5/0.25/ /0.25/ $$(i)盐溶液A/5/ /5/5/5$$(j)盐溶液B/5/5/5/5/5$$(k)色氨酸溶液/ /25/ / / $$(l)维生素溶液Ⅰ/10/ / / / $$(m)维生素溶液Ⅱ/10/ / / / $$(n)维生素溶液Ⅲ/ /50/ / / $$(o)维生素溶液Ⅳ/ / /5/5/ $$(p)维生素溶液Ⅴ/ / /5/ / $$(q)维生素溶液Ⅵ/ / / /5/ $$(r)黄嘌呤溶液/5/5/ / / $$(s)酵母添加溶液/ / / / /5$$固体/g/g/g/g/g$$抗坏血酸/1/ / / / $$L-半胱氨酸·HCl·H2O/ /0.19/ / / $$L-胱氨酸/0.1/ / / / $$无水葡萄糖/10/10/10/10/15$$谷胱甘肽/ /0.0013/ / / $$K2HPO4无水/ /1.6/ / / $$NaOAc·3H2O/8.3/ /8.3/8.3/ $$柠檬酸钠·2H2O/ /13/ / / $$D,L-色氨酸/0.1/ / / / $T
B.b 琼脂培养基
于500ml液体培养基(a)中加入5.0-7.5g琼脂,在蒸汽浴上加热搅拌直至琼脂溶解,将热溶液按每支试管约10ml量置于各试管中,加塞防止污染。在高压釜中于121-123℃灭菌15min,尽快冷却直立的试管,以减少颜色的生成。于10℃暗处贮存。
B.c 悬浮介质
用等体积的水稀释一定量的适当的基础培养基贮备液,表24-3,各取10ml加至试管中,加塞防止污染,在高压釜中于121-123℃灭菌15min,尽快冷却以减少颜色的生成。于约10℃暗处贮存。
C 试验生物菌种的贮备培养基
适当的试验生物菌种,按下列指明的,用大于等于1支试管的琼脂培养基{B(b)],在30至40℃间选择合适的温度恒定在±0.5℃以内,培养6-24h,最后于约10℃暗处贮存。在实验中使用新培养物之前,在1-2周内进行几次连续转种培养。$$,制备新鲜的穿刺培养基,每周大于等于1次,不要使用超过1周的陈旧培养基进行接种。$$每天或每两天作穿刺培养的转种,以增加生长缓慢培养物的活性。如果在液体接种,在液体接种后2-4h,便可以看到一定的浊度,则可认为该生物活性是满意的。生长缓慢的培养物很少能给予合适的响应曲线,因而可能导致错误的结果。
C.a 莱希曼氏乳酸杆菌
ATCC No.8043供钻胺素测定用。
C.b 粪链球菌
ATCC No.8043。供叶酸测定用。
C.c 植物发酵乳酸杆菌
ATCC No.8014。供烟酸及泛酸测定用。
C.d 络蛋白亚种拟乳酸杆菌
ATCC No.7469。供核黄素测定用。
D 测试管
用适当的方法仔细地清洗〔USP的十二烷基硫酸钠作为洗涤剂是满意的〕硬质玻璃试管,约20×150mm及其他必要的玻璃器皿。〔试验生物对微量的生长因素及许多清洁剂高度敏感。因此最好在清洗后接着在约250℃加热1-2h,这点在维生素B12钴胺素测定中特别重要。〕$$按下述方法制备含适当的标准溶液的试管:取同样的试管一式两份〔平行〕〔或复制品〕分别加入0.0〔未接种的空白〕,0.0〔接种的空白〕,1.0,2.0,3.0,4.0及5.0ml标准溶液。$$按下述方法制备含适量的测定溶液的试管:取同样的试管一式两份,分别加入1.0,2.0,3.0,4.0ml测试溶液。$$对每支标准溶液及测试溶液试管中加水至5.0ml,再加5.0ml适当的基础培养基贮备液,并混匀。适当地盖好试管以防细菌污染,并在高压釜中于121-123℃灭菌〔小于等于10min内达到此温度〕。〔滴定法为10min,比浊度法为5min〕尽快冷却以减少颜色生成。在整个测定过程中注意保持灭菌及冷却条件一致,在灭菌锅中试管包扎过紧或过多,都可能引起加热速率的变化。$$除去第一组含0.0ml的标准溶液〔未接种的空白〕的对照〔或重复〕试管外,对其它试管都加1滴适当的接种液〔无菌接种〕,于30至40℃间选定温度使恒定在±0.5℃内,培养时间按滴定法或比浊法所规定时间,测试管如有任何外来生物的污染则测试无效。