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食品提取物中的维生素B6
维生素和其它营养物
- 微生物法
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A 试剂
〔所有含维生素B6的溶液应在弱光下操作〕
A.a 醋酸钾缓冲液
A.a.1 0.01M,pH4.5
溶解0.981g KOAc于水中、并稀释至1L,用HOAc调节pH。
A.a.2 0.02M,pH5.5
溶解1.96g KOAc于水中并稀释至1L,用HOAc调节pH。
A.a.3 0.04M,pH6.0
溶解3.92g KOAc于水中,并稀释至1L,用HOAc调节pH。
A.a.4 0.1MpH7.0
溶解9.815g KOAc于水中,稀释至1L,用HOAc或KOH溶液调节pH。
A.b 氯化钾-磷酸盐缓冲液
pH8.0。溶解746g KCl及17.4g K2HPO4于800ml水中,并用HOAc调节pH,稀释至1L。
A.c 离子交换树脂。
A.d 酸水解酪蛋白液
100mg/ml。〔注意:见有关蒸馏和真空的安全事项〕。将100g不含维生素的酪蛋白与500ml恒沸的HCl〔约5N HCl,208ml HCl用水稀释至500ml〕混合并回流8h,真空蒸馏除去混合物中的HCl直至残留物呈粘稠浆状物,保持水浴温度小于80℃,溶解浆状物于水中。以相同方法再次浓缩,再溶解浆状物于水中。$$用40%NaOH调节至pH4,加水至约600ml,加40g活性炭,搅拌4h,经铺有一层盐酸洗过的布氏漏斗真空抽滤。如果溶液不清亮和有颜色,则继续用活性炭处理。加20g活性炭至滤液中,搅拌1h,再过滤,重复加10g为1份活性炭处理并过滤,当溶液清亮无色时,用水稀释至1L〔溶液稀释定容前可加入6N HCl 2-3ml,以抑制微生物生长〕。于冰箱中贮存。
A.e 维生素溶液Ⅰ
溶解10mg硫胺素和1g肌醇于约200ml水中,并稀释至1L,于冰箱内贮存。(1ml=10μg硫胺素和1mg肌醇〕。
A.f 维生素溶液Ⅱ
溶解10mg生物素于100ml 50%乙醇中,于冰箱中贮存。(1ml=10μg生物素)溶解200mg泛酸钙和200mg烟酸于约200ml水中,加入8ml生物素溶液并用水稀释至1L。贮存于冰箱中〔1ml=200μg的泛酸钙和200μg的烟酸及0.8μg生物素〕。
A.g 盐溶液Ⅰ
溶解17g KCl,10.3g MgSO4·7H2O,100mg FeCl3·6H2O和100mg MnSO4·H2O于约800ml水中,加入2ml HCl。溶解5g CaCl2·2H2O于约100ml水中,加至前面溶液中,并用水稀释至1L。贮存于冰箱中(1ml=17mg KCl,10.3mg MgSO4·7H2O,100μg FeCl3·6H2O,100μg MnSO4·H2O及5mg CaCl2·2H2O)。
A.h 盐溶液Ⅱ
溶解22g KH2PO4和40g (NH4)2HPO4于水中,并稀释至1L,贮存于冰箱中(1ml=22mgKH2PO4及40mg(NH4)2HPO4〕。
A.i 多乙氧基醚液
称取2.5g多乙氧基醚于小烧杯中,用温水〔45℃〕转移并稀释至500ml。贮存于冰箱中。(1ml=5mg多乙氧基醚)。
A.j 柠檬酸溶液
(1+1)。溶解50g柠檬酸于50ml水中,盛于塑料塞的瓶中,室温贮存。
A.k 磷酸铵溶液
(1+2)。溶解25g (NH4)2HPO4于50ml水中,盛于塑料塞瓶中,室温贮存。
A.l 吡哆素、吡哆醛和吡哆胺标准溶液
按下述方法分别制备每个溶液:
A.l.1 贮备液
10.0μg/ml,将12.16mg盐酸吡哆素,12.18mg盐酸吡哆醛和14.34mg盐酸吡哆胺分别溶解于1N HCl中,并用1N HCl稀释至1L,置玻塞瓶中,冰箱贮存。
A.l.2 中间溶液
1.0μg/ml。用水稀释10ml贮备液至100ml。
A.l.3 工作溶液
1.0ng/ml,用水稀释5ml中间溶液至500ml,并混合,再用水稀释10ml至100ml,每次测定新鲜制备。
A.m 吡哆素、吡哆醛、吡哆胺混合液〔作液体肉汤培养基用〕
吸取每种中间溶液(1.0μg/ml)2ml至1L容量瓶,并用水稀释定容。
A.n 柠檬酸盐缓冲液
溶解100g柠檬酸钾和20g柠檬酸于水中,并稀释至1L。贮存于冰箱中(1ml=100mg柠檬酸钾及20mg柠檬酸)。
A.o 基础培养基贮备液〔供200管用〕
配制1L培养基,加到约400ml水中的有:100ml柠檬酸盐缓冲液、100ml水解酪蛋白溶液、50ml维生素溶液Ⅰ、25ml维生素溶液Ⅱ、50ml盐溶液Ⅰ和50ml盐溶液Ⅱ。溶解100g葡萄糖于此溶液,在小烧杯中用10ml HCl(1+9),将22mg DL-色氨酸、27mgL-组氨酸HCl、100mgDL-蛋氨酸、216mgDL-异亮氨酸和256mg DL-缬氨酸溶解并加至上述溶液中。加入20ml多乙氧基醚溶液,用柠檬酸(1+1)或(NH4)2HPO4(1+2)溶液调节至pH4.5。用水稀释至1L,贮于玻璃瓶,加棉塞置冰箱中,在使用前24h内制备。制好后,蒸汽浴加热10min并冷却。
A.p 试验微生物
葡萄杆酵母菌(ATCC No.9080)。保持每周转接种至麦芽琼脂斜面(g)上,于30℃培养新接种的琼脂斜面24h,并冷冻。
A.q 琼脂培养基
在有500ml刻度的广口瓶锥形瓶中,将25g琼脂悬浮于约400ml水中,加盖防止污染,通蒸汽10min,以溶解琼脂并定容至500ml。吸取每份10ml热的琼脂移至20×150mm试管中,加脱脂棉塞,于121℃高压釜灭菌15min。由于这种培养基有酸反应,避免过热,否则将使培养基较软。斜置热琼脂管以形成斜面,并于该位置让其冷却。
A.r 液体培养基
吸取5ml混合液至16×150mm试管中,试管中放有两粒4mm玻璃珠,加盖以防污染。于121℃高压釜灭菌10min。在无菌条件下加入5ml蒸汽灭菌过的不含维生素B6的基础培养基,试管贮于冰箱中。
A.s 接种淋洗液
吸取5ml水至试管中,加盖以防污染,于121℃高压灭菌10min,于无菌条件下加入5ml蒸汽灭菌过的不含维生素B6的基础培养基试管贮于冰箱中。
B 测定用接种液
在使用前于30℃将接种在琼脂上的细胞培养24h,于无菌条件下转接这些细胞至盛有液体肉汤培养基的试管中,加脱脂棉塞,并用胶带封住〔或其它盖子〕,以防污染,放试管于振荡器中,于30℃室温下振摇20h,用灭菌的胶塞更换棉塞,于2500r/min离心1.5min,倾去上层清液,重新将其悬浮于10ml的无菌接种洗涤液中,于2500r/min离心1.5min,倾去上层清液,再悬浮于第2份10ml灭菌的接种洗涤液中,离心1.5min并倾去清液,将细胞悬浮于第3份10ml接种洗涤液中,该液即测定用接种液。
C 交换树脂和柱子的制备
于250gH型的Dowex AG 50w×8〔100-200目〕树脂中,加入过量的6N KOH直至上层对石蕊呈蓝色。放置沉降,倾泻并用水洗涤树脂直至上层液变清。加入约600ml 3N HCl、搅拌、在沸水浴中加热0.5h,倾泻并用3N HCl重复处理两次,洗涤树脂,直至洗出的水呈中性,加入6N KOH至pH为强碱性,并搅拌1h,用水洗涤至洗出水呈中性。悬浮于2M KOAc中,贮存于冰箱中。临用前,用水洗涤树脂至水对溴百里酚兰呈绿色,树脂可以再生,自用3N HCl处理开始。$$制备管子,熔封毛细管活塞,1.5mm孔径和50mm侧管至22mm外径大于等于400mm玻管上。加5-10ml水至管内,放玻璃棉于管底并除去毛细管与玻璃棉中的气泡,用水将从水悬浮液中沉降出来的30ml制备好的树脂冲洗至管子中。待树脂在管中沉降后,将玻璃棉塞于树脂顶部,先用50ml热水淋洗柱子,接着用每份50ml 0.01M热KOAc(pH4.5)冲洗瓶子2次,最后从柱子上流下的缓冲液pH应为4.5;否则仍需用缓冲液再洗,任何时候都不要让液面降到顶部玻璃棉塞的下面。
D 样品的制备
称取1-2g干样品至500ml锥形瓶中,对植物类样品加入200ml 0.44N HCl,对动物类样品加200ml 0.055N HCl。植物溶液于121℃高压釜加热2h,动物溶液于121℃高压釜加热5h,冷至室温,用6N或饱和KOH调节至pH4.5,在容量瓶中用水稀释至250ml;经What man40号滤纸过滤,取滤出部分40-200ml作色谱。
E 色谱法
将所需量的滤后提取液按50ml为一份至离子交换柱上,流量不控制让其全部流过,用约5ml为1份的0.02M热KOAc(pH5.5)溶液,洗涤烧杯和柱共3次,随后用同样方法洗涤柱的侧柱。用同一溶液冲洗柱,直至所用的0.02M KOAc(pH5.5)溶液的总体积为100ml。用2份50ml煮沸的0.04M KOAc(pH6.0)溶液洗脱吡哆醛,以100ml容量瓶作接受器。用2份50ml煮沸的0.1M KOAc(pH7.0)洗脱吡哆素,以100ml容量瓶作接受器,用2份50ml煮沸的KCl-K2HPO4(pH8.0)洗脱吡哆胺,用250ml烧杯作接受器。调节pH至4.5。除另有要求外,吡哆素及吡哆醛洗脱液用水稀释至100ml,吡哆胺稀释至200ml。$$对标准的吡哆素、吡哆醛和吡哆胺,取每个中间溶液各10ml混合,以KOH中和,用HOAc调至pH4.5。放此液于柱中。淋洗,并按上述收集洗脱部分。用水稀释吡哆素及吡哆醛标准的洗脱溶液至100ml,吡哆胺洗脱液调至pH4.5后,用水稀释至200ml。用水稀释洗脱标准至1.0ng/ml。
F 测定
于260℃加热清洁的试管及玻璃珠2h,放2泣4mm玻璃珠至每支16×150mm具有螺旋盖的玻璃培养管中。对标准曲线,吸取适量新鲜制备的标准工作溶液于各试管中,合各管分别含0.0,0.0,1.0,2.0,3.0,4.0及5.0ng吡哆素、吡哆醛或吡哆胺。一式3份。同样制备一组洗脱标准液,但省去空白管。稀释来自色谱柱的样品洗脱液,使其维生素B6的含量为1ng/ml。吸取1,2,3,4及5ml稀释过的洗脱液至3组管中,分别加适量水使其体积为5ml。盖上塑料盖,盖顶端有个3mm的孔,于121℃将全部管组在高压釜加热10min,冷至室温,用具有无菌输液装置的自动吸管经盖孔吸取5ml蒸汽消毒过的培养基,加至管中,用无菌的干酪布盖上管子,放于冰箱中。接种前1h从冰箱取出。于无菌条件下〔除标准曲线的第一组0.0以外〕经各管的盖子接种,滴加一滴葡萄糖酵母菌悬浮细胞的测定接种液,注意保持细胞悬浮液的均匀性,因细胞可在接种过程中沉降。在温控房间〔30℃〕将管子置恒速旋转振荡器上培养22h,在高压釜灭菌5min,冷却,除去盖子,在分光光度计上550nm处读取%T,用水设定100%T,读取未接种空白的%T,用未接种空白设定100%T,读取接种空白值。将9个未接种空白管混合,用这个混合空白将仪器设定在100%T,读取其它各管的%T。$$取3组管子的平均读数,以%T对各管中洗脱的标准吡哆素、吡哆醛或吡哆胺的ng量在半对数坐标纸上作图。用内插法求出样品管中吡哆素、吡哆醛或吡哆胺的量,报告每克样品含吡哆素、吡哆醛或吡哆胺的微克数。