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    牛奶、维生素制剂和饲料浓缩剂中的维生素D

    维生素和其它营养物

    大鼠生物测定法
        〔不适用于家禽饲料制品〕
    A 定义
        测定组是指在测定期间内摄取测试样品〔维生素D样品〕的大鼠群。测试样品是指测定维生素D效价的样品。测试溶液是指皂化后准备作饲料用的样品油溶液。测定期指大鼠的第八或第十一天至耗尽的最后日子的这段生命期。分组指选择大鼠并分组以便饲料、管理及观察的过程。每天指测定期间头6或8天的每一天。耗尽期指大鼠于预备期的最后一天与测定期的第一天之间的这段生命间隔。剂量指在测定周期内,每天饲于大鼠的参比油溶液、测定牛奶或其它添加剂的量。喂饲指已准备好的测试物便于大鼠摄取或口服给药,组指在测定周期内保持相同喂饲制度的7只或7只以上大鼠。预备期指大鼠在出生后的第7天至耗尽期的第一天之间的生命间隔。
    B 试剂
        
    B.a 面筋粉
        从面粉制取的清洁完好的产品,几乎全部去掉淀粉,含小于等于10%水,按无水计大于等于14.2%N,无N提取物小于等于15%〔采用蛋白因子5.7〕和淀粉含量小于等于5.5%〔用淀粉酶法测定〕
    B.b 参比油
        USP维生素D2或维生素D3参比标准。
    B.c 棉籽油
        
    B.d 致佝偻病食谱
        76%全黄玉米,研碎通过30号筛;20%面筋,研碎通过30号筛;3%CaCO3和1%NaCl,将上述组分混合。
    C 样品的保存
        贮存样品,使其尽可能少地暴露于热、光及空气下,收集牛奶样品后,立即以原容器运送或输送前先放入冰库贮存,在送到分析者后,奶样应在小于等于10℃下冷冻小于等于10天。或于1qt牛奶中加入2滴10%HcHo溶液后于小于等于10℃下冷藏小于等于30天。浓缩的或复制的牛奶的保存和上述液体牛奶一样。酸化的或凝结的奶样不适于测定。干牛奶样的保存,在分析者开封以后于小于等于10℃冷藏。
    D 样品
        样品应由大于等于10g的食品组成。10个胶囊或10粒片剂或足量的液体,以满足全部分析的需要。$$如果样品中维生素D的量相当于喂饲部分含P量<5mg,样品可以直接喂饲。如果这部分含P>5mg,样品就必须皂化。$$维生素样品的所有处理及稀释所用的物料必须已知不含维生素D。
    E 直接喂饲样品的制备
        
    E.a 浓缩剂饲料及片剂
        只要耗竭期>18天而小于等于25天,并出现具有特征性的佝偻病摇摆步态和关节肿大等症候,则这些大鼠就适于测定期。可借助于对一只同窝大鼠小腿骨的“钙线试验”[L]检查,或通过对其小腿骨的X射线检查,以确证大鼠的佝偻病,每笼放一只大鼠,让其任意摄取佝偻病饮食,自由饮水。在整个测定周期中,每日都必须让试验组和参比组大鼠摄取致佝偻病饮食,它是由同批组分混合而成的饮料。$$喂饲参比油溶液和样品溶液,可任选以下方法,但任一测试都必须按同一种方法饲予参比油溶液和样品溶液。测定周期的第一日可饲予补充物〔参比油溶液或样品溶液〕;或7日和10日测定期的第1、3和5日或第1和3日或第1和4日;或7日测定期的头6日或10日实验期的头8日给予等分补充物。补充物可与7日测定期的头5天或10日测定斯的头8天内所消耗的基础饲料混合后给予,此外在测定期的其余时间中,均应食用不掺合补充物的饲料。$$饲予的参比油量可发展佝偻病骨骺端钙化,钙化的范围和程度按经验判断相当于“钙线试验”图上的4.0。根据要求和假定的样品中维生素D含量,就可推算出与饲予的参比油中含有相同IU维生素D的所应饲给的样品溶液的体积。$$测定周期结束后,处死大鼠,检查大于等于1条腿骨,根据L的“钙线试验”,以了解其对佝偻病干骺端的治疗效果。$$饲喂参比油前,可用不含维生素A和D的食用植物油稀释。稀释油须贮于低于10℃的暗处,为期不应超过30天。每天每只饲予的稀释油量不应超过0.2ml。测定期间,应尽可能保持试验组和参比组的所有环境条件〔尤其对生理活性的辐射〕的一致性。
    E.b 胶囊
        充分粉碎已称重的样品。迅速称取已磨碎的样品粉末的一部分,并再次用等重的食用植物油研磨,加入适量的蔗糖粉使测定剂量中含蔗糖1-2g。再次研磨混合,并按K测定期所述的方法操作。
    E.c 油类
        加入适量食用植物油,以使稀释液按体积计,所含的测定剂量与参加稀释液相等。
    E.d 易与水混合的液体
        用水、甘油或丙烯甘油,如油类的稀释,以方便喂养。
    F 皂化制备样品
        称取样品移至皂化瓶中。〔对牛奶见G〕。$$如是胶囊或片剂,放大于等于10个片至小回流瓶,加10ml水。在蒸汽浴上加热10min,用钝头玻璃棒压碎每个胶囊或片剂,并再加热5min,加入2ml棉籽油及一定体积的KOH(50%,w/w),后者的加入量应为样品加棉籽油总量的每g用2.5ml。但应大于等于15ml,加入50ml乙醇,在100℃水浴上回流30min,冷却溶液,并用50ml水转入Squibb型分液器中,每次用30ml不含过氧化物的乙醚〔可用USP麻醉乙醚〕提取4次,用一些水或少量乙醇打碎可能形成的乳胶,用水洗合并的醚层4次,操作如下:〔1〕100ml轻轻旋摇;〔2〕100ml缓缓摇动;〔3〕50ml缓缓振摇;〔4〕50ml剧烈振摇。用两份75ml饱和NaCl溶液剧烈振摇干燥乙醚提取液2次,转移乙醚提取液至烧杯中,并在蒸汽浴上蒸发至适当体积,如有水存在,如无水Na2SO4 3-5g脱水,倾入称重的容器中,另用3-5份乙醚洗涤烧杯及硫酸钠,合并所有的洗液至称重的容器,在蒸汽浴上蒸发乙醚至不再可闻到醚味,称取脂肪重,乘以1.10以确定体积,并加入食用植物油使得到喂饲方便的最终稀释物,充分混合〔电磁搅拌是合用的〕。
    G 牛奶样品的制备
        称取样品移至皂化瓶中。〔对牛奶见G〕。$$如是胶囊或片剂,放大于等于10个片至小回流瓶,加10ml水。在蒸汽浴上加热10min,用钝头玻璃棒压碎每个胶囊或片剂,并再加热5min,加入2ml棉籽油及一定体积的KOH(50%,w/w),后者的加入量应为样品加棉籽油总量的每g用2.5ml。但应大于等于15ml,加入50ml乙醇,在100℃水浴上回流30min,冷却溶液,并用50ml水转入Squibb型分液器中,每次用30ml不含过氧化物的乙醚〔可用USP麻醉乙醚〕提取4次,用一些水或少量乙醇打碎可能形成的乳胶,用水洗合并的醚层4次,操作如下:〔1〕100ml轻轻旋摇;〔2〕100ml缓缓摇动;〔3〕50ml缓缓振摇;〔4〕50ml剧烈振摇。用两份75ml饱和NaCl溶液剧烈振摇干燥乙醚提取液2次,转移乙醚提取液至烧杯中,并在蒸汽浴上蒸发至适当体积,如有水存在,如无水Na2SO4 3-5g脱水,倾入称重的容器中,另用3-5份乙醚洗涤烧杯及硫酸钠,合并所有的洗液至称重的容器,在蒸汽浴上蒸发乙醚至不再可闻到醚味,称取脂肪重,乘以1.10以确定体积,并加入食用植物油使得到喂饲方便的最终稀释物,充分混合〔电磁搅拌是合用的〕。
    H 预备期
        整个预备期间,每只大鼠都应在直接监督下或按规定的方法进行饲养。整个预备期保持大鼠既定的食谱,以保证其全面正常发育。除了限制供给维生素D外,应使21-32日龄大鼠体重为40-60g。并在大鼠摄取相应的致佝偻病饮食,存活18-25天就出现严重的佝偻病。
    I 耗竭期
        当大鼠的年龄小于等于30天,体重>44g而小于等于60g没有出现损伤、疾病或解剖学上的异常,不致影响生长发育。则这些大鼠适用于耗竭期给每个大鼠以佝偻病饮食,任意量的水。
    J 测试周期的大鼠分组
        将适用于测试周期的大鼠分组。对每个样品提供大于等于1个测定组,在测定每一个样品时,至少须提供一个参比组,但这个参比组可用于大于等于1个样品的同时测定。〔当需设2个参比组时,必须选择剂量水平,使高低剂量之比不<1.5或>2.5。样品的剂量基于每个样品的假定效价可以相当于参比水平或相当于二个参比剂量乘积的平方根〕。在大鼠分组期间的任一天,指定分配到任一剂量小组中的大鼠总数不准超过同日分配到其它剂量组的两只。当所有组的分完后,每个剂量组的大鼠总数必须相同。一般从同窝中分配到每一剂量组的大鼠应不多于3只。除非同窝中有同样数量的大鼠被分配到参比组。每个组必须有足够数量的动物,以满足N规定的要求。
    K 测定周期
        只要耗竭期>18天而小于等于25天,并出现具有特征性的佝偻病摇摆步态和关节肿大等症候,则这些大鼠就适于测定期。可借助于对一只同窝大鼠小腿骨的“钙线试验”[L]检查,或通过对其小腿骨的X射线检查,以确证大鼠的佝偻病,每笼放一只大鼠,让其任意摄取佝偻病饮食,自由饮水。在整个测定周期中,每日都必须让试验组和参比组大鼠摄取致佝偻病饮食,它是由同批组分混合而成的饮料。$$喂饲参比油溶液和样品溶液,可任选以下方法,但任一测试都必须按同一种方法饲予参比油溶液和样品溶液。测定周期的第一日可饲予补充物〔参比油溶液或样品溶液〕;或7日和10日测定期的第1、3和5日或第1和3日或第1和4日;或7日测定期的头6日或10日实验期的头8日给予等分补充物。补充物可与7日测定期的头5天或10日测定斯的头8天内所消耗的基础饲料混合后给予,此外在测定期的其余时间中,均应食用不掺合补充物的饲料。$$饲予的参比油量可发展佝偻病骨骺端钙化,钙化的范围和程度按经验判断相当于“钙线试验”图上的4.0。根据要求和假定的样品中维生素D含量,就可推算出与饲予的参比油中含有相同IU维生素D的所应饲给的样品溶液的体积。$$测定周期结束后,处死大鼠,检查大于等于1条腿骨,根据L的“钙线试验”,以了解其对佝偻病干骺端的治疗效果。$$饲喂参比油前,可用不含维生素A和D的食用植物油稀释。稀释油须贮于低于10℃的暗处,为期不应超过30天。每天每只饲予的稀释油量不应超过0.2ml。测定期间,应尽可能保持试验组和参比组的所有环境条件〔尤其对生理活性的辐射〕的一致性。
    L 钙线试验
        在胫骨近侧端或挠骨〔或尺骨〕远侧端进行“钙线试验”。从动物身上翦断需用骨的终端,消除粘附的组织。通过骨端用干净、锋利的刀片作中线纵断面,以暴露通过骺和骨干接界的平表面。在任一实验中,全部动物都应采用同一种骨骼,切开同一平面。将骨的两切面放入水中漂洗,并在2%AgNO3溶液中浸泡1min,然后再在水中漂洗切面。并将水中已切开的表面暴露于日光或其它老化光效应的光线下,直至钙化区清楚地显现出染色的轮廓和非钙化区无明显变色为止。立即记录每一切面的佝偻病骨骺端钙化的范围和程度。$$可改进染色方法,以便能更清晰的辨别钙化和非钙化区。适当的替代方法是取刚切开的骨骼,按下述方法进行操作:〔1〕在乙醚-丙酮混合液中(1+3)浸泡5min以上〔当骨切面干燥后,为了方便和易于处理,暂时可用橡胶粘结剂将骨切面固定在标准的显微镜载片上,其余步骤在Coplin染色缸内进行〕;〔2〕在乙醇液中浸泡10min;〔3〕在丙酮中浸泡10min;〔4〕在水中浸泡40min。经1,10,20和30min后,骨切面发生变化;〔5〕用2%AgNO3溶液染色60s;〔6〕于暗处用水冲洗40min。1,10,20和30min后,全部发生变化。将水中已着色的切面暴露于日光或其它的光化光效应的光线下。直至显现出染色。$$根据图24-6A所示的标度,记录每只大鼠佝偻病骨骺端钙化程度。由于图中所示的钙线与实际上记录到的治疗性钙线稍有不同,故必须目测钙线,并与图中的相当钙线进行比较。肉眼观测的钙线似乎是致密的、连贯的。图24-6B所附的桡骨切面的照片,具体说明了图的用法。
    M 数据记录
        测定周期开始之日和实验期的第7或第10天〔根据实验期的不同而定〕记录每只鼠的体重。在测试周期内,持续记录每只大鼠每日的致佝偻病饮食的消耗量。对照“钙线试验”图。将“钙线试验”中受检骨骼的钙化范围和程度赋予一定数值。这样,便可求出每组疗效的平均值。
    N 测定样品的效价
        只有当测定周期结束,大鼠体重等于或超过测定周期开始日的体重时,以及从喂饲起的24h内能吃光规定的每个样品剂量时,才承认所得的大鼠据对于确定测试样品中的维生素D的效价是有效的。$$只有当参比组中,有2/3或更多符合体重标准的大鼠〔不得少于7只〕显现出的佝偻病干骺端钙化程度相当于“钙线试验”图上的大于等于0.5和小于等于8.0级别范围时,才承认所得的参比组数据对于确定测试样品中维生素D的效价是有效的。$$当试验组中7只或更多符合体重标准的大鼠数时,才承认所得的实验数据对于确定测试样品中维生素D的效价是有效的。$$当试验组动物的平均响应值等于或高于参比组的平均响应值时,就认为测定周期内喂饲样品中的维生素D的含量等于或高于同期间喂饲参比油中的维生素D含量。当试验组动物的平均响应值低于参比组,且试验组中显现出佝偻病骨骺端钙化度相当于“钙线试验”图上大于等于0.5级别的大鼠数不到半数,就认为测定周期内喂饲样品中维生素D含量低于同期喂饲参比油中的维生素D含量。当试验组〔A〕动物的平均响应值低于参比组〔R〕,并且如试验组中显现出佝偻病骨骺端钙化度相当于“钙线试验”图上大于等于0.5级别的大鼠数超过半数,而且
    N.1 试验级和参比组大鼠为非同窝配对
        则t^2^=C^^u^^(Y^^R^平均^-Y^^A^^平均)^2^/S^2^^^u^^$$式中:C^^u^^=n^^A^^n^^R^^/(n^^A^^+n^^R^^)$$S^2^^^u^^=(∑Y^2^-n^^R^^ (Y^^R^^)^2^平均-n^^A^^(Y^^A^^)^2^平均)/(n^^A^^+n-2)$$Y^^R^^平均为参比组平均记分,Y^^A^^平均为试验组平均记分,∑Y^2^为所单个记分的平方和,n^^A^^为试验组大鼠数,n^^R^^为参比组大鼠数。从表24-5中查t^2^值。表中的d.f.为自由度=(n^^A^^+n^R^^-2)。
    N.2 试验级和参比组大鼠为同窝配对
        参比组中大鼠响应值减去试验组中同窝酸对大鼠的响应值,保留偏差符号。则:$$ t^2^=n^^p^^D^2^/S^2^^^D^^$$式中:n^^p^^为配对数;D^2^为均差平方,D为均差,S^2^^^D^^为差数方根=(∑D^2^-n^^p^^D^2^)/(n^^p^^-1),∑D^2^为差数平方和。从表24-5中查t^2^值,此处d.f.=n^^p^^-1。$$如果计算出的t^2^值大于表中查出的t^2^值时,就认为测定周期内喂饲样品中的维生素D含量低于同期喂饲参比油中的维生素D含量;另一方面,若S^2^^^U^^<1.5或S^2^^^D^^<2.5,就认为样品中的维生素D含量等于或高于参比油中的维生素D含量。若S^2^^^U^^>1.5或S^2^^^D^^>2.5,则这种测定数据就不宜于确定测定样品的效价〔则必须继续进行补充实验或重复试验〕。$$t^2^和S^2^的计算方法举例如下:
    N.2.1 非配对数据
        治疗效果记分$$$T参比/测定$$3.62/4.00$$3.12/4.37$$6.00/2.37$$5.50/2.00$$4.25/3.75$$5.50/2.50$$4.75/4.00$$_/_$$均值=Y平均= 4-68/3-28$T∑Y^2^=240.9901$$C^^u^^平均=(n^^A^^×n^^R^^)/(n^^A^^+n^^R^^)=〔7×7〕/(7+7)=3.5$$S^2^^^u^^=(∑Y^2^-n^^R^^(Y^2^^^A^^平均)-n^^A^^(Y^2^^^A^^平均))/(n^^A^^+n^^R^^-2)$$=[240.9901-7(4.68)^2^-7(3.28)^2^]/12$$=1.0304$$t^2^=(C^^u^^/S^2^^^u^^)(Y^^R^^平均-Y^^A^^平均)^2^$$=(3.5/1.0304)(4.68-3.28)^2^$$=6.658$$d.f.=n^^R^^+n^^A^^-2=12$$表中,当d.f.=12时,t^2^值=3.176。$$计算出的t^2^值(6.658)大于表中d.f.为12时所查到的t^2^值(3.176),故测试样品中维生素D含量低于参比油中的维生素D含量。由于S^2^^^u^^ (1.0304) <1.50,故测定有效。$$$T表24-5 t^2^值$$d.f./t^2^$$6/3.375$$7/3.591$$8/3.460$$9/3.360$$10/3.283$$11/3.226$$ 12/3.176$$13/3.136$$ 14/3.101$$ 15/3.073$$16/3.049$$17/3.028$$18/3.007$$19/2.989$$20/2.976$$21/2.962$$22/2.948$$23/2.938$$24/2.928$$25/2.917$$ 26/ 2.910$$ 27/2.900$$ 28/2.893$$29/2.887$$30/2.880$T
    N.2.2 配对资料
        治疗效果记分$$ $T窝/参比/测定/差数$$1/4.02/4.40/-0.38$$2/3.52/4.77/-1.25$$3/6.40/2.77/+3.63$$4/5.90/2.40/+3.50$$5/4.65/4.15/+0.50 $$6/5.90/2.90/+3.00$$7/5.15/4.40/+0.75$$均值=D平均/ / /=1.39$$∑D^2^/ / /=36.9463$TS^2^^^D^^=(∑D^2^-n^^p^^D^-2^)/(n^^p^^-1) =[36.9463-7(1.39)^2^]/6=3.9036$$t^2^=(n^^p^^D^-2^)/(S^2^^^D^^)=7(1.39)^2^/3.9036=3.4647$$d.f.=n^^p^^-1=6$$表中,当d.f.=6时,t^2^值为3.775$$虽然计算出的t^2^值(3.4647)小于表中d.f.为6时所查到的t^2^值(3.775),这表明测试样品中的维生素D含量等于或高于参比油中的维生素D含量,但是由于S^^D^^值大于2.5,故此测定数据不宜用于确定测试样品的效价,必须进行重复试验。
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