中国化工网首页 >> 化工助手 >> 化学物质分析方法数据库
营养添加剂中的有效赖氨酸
维生素和其它营养物
- 自动测定法
-
A 原理
1-氟-2，4-二硝基苯〔DNFB〕与蛋白质中游离∈-氨基反应，生成DNFB-∈-氨基赖氨酸，此产物不为酸水解，样品经酸水解后，用氨基酸分析仪测定无效赖氨酸。对未经酸水解的样品测定总赖氨酸，二者之差即为与DNFB结合的有效赖氨酸。
B 试剂
〔全部用无离子水〕
B.a 柠檬酸钠缓冲液
pH2.20±0.03。溶解19.6g柠檬酸钠·2H2O于H2O中，加入16.5ml HCl，5.0ml硫二甘醇〔TG〕，1.0g Brij-35〔加热使溶于H2O中〕和0.1ml正辛烷，并稀释至1L，用前过滤。
B.b 柠檬酸钠缓冲液
pH5.28±0.02。溶解137.26g柠檬酸钠·2H2O于H2O中，加26.0ml HCl，4.0g Brij-35〔加热溶解于H2O中〕和0.4ml正辛酸，并稀释至4L，用前过滤。
B.c 含2%正丙醇的柠檬酸钠缓冲液
pH5.28±0.02。溶解137.26g柠檬酸钠·2H2O于H2O中，加26.0ml HCl，4.0g Brij-35〔加热溶解于H2O中〕和0.4ml正辛酸，并稀释至4L，用前过滤。
B.d 醋酸钠缓冲液
4N pH5.51±0.03，加1088g NaOAc·3H2O至800ml H2O中，在蒸汽浴或水浴上边加热边搅拌直至溶解完全，冷至室温，搅拌下加入200ml HOAc；加H2O至最终体积为2L，必要时调节pH(1g NaOH/2L可使pH改变0.02)，用前过滤。
B.e 再生试剂
制备含1g Brij-35/L的0.2N NaOH溶液。
B.f 茚三酮试剂
在无氧情况下制备并转移至储器。当混合和搅拌时让缓慢的氮气流小泡通过溶液以赶尽溶液中的空气。用配有无缝的聚四氟乙烯棒0.5×3"的磁搅拌器搅拌。加入3L滤过的不含过氧化物的甲基溶纤剂〔当3ml溶液与3ml 4%KI溶液混合时必须不产生颜色〕。至1L滤过的4N NaOAc缓冲液中，在以1ft^3^/h的速度通入氮气的情况下，电磁搅拌15min。加入80g茚三酮[注意：在通风橱中称重，边通氮气，边搅拌，直至茚三酮全部溶解〔通常需6－10min〕]。准确称取1.6g SnCl2·2H2O，加到溶液中，用甲基溶纤剂冲洗至最终体积。当SnCl2溶解时，试剂变为深红宝石色，但在约2h后消褪为黄绿色，随后变为黄棕色。继续通氮气搅拌直至SnCl2完全溶解〔约3－8min〕。
C 蛋白质水解液的制备
用配备有20号筛的研磨机，将样品磨碎、混匀。称取0.1－1.0g样品至坩埚中。〔计算样品重，使在用100ml pH2.2的柠檬酸钠缓冲液稀释后得到最终浓度为0.72－0.88mg蛋白质/ml。$$所用样品毫克数＝[所需要蛋白质最终浓度(mg/ml)×100(ml)]/〔样品中蛋白质%/100〕，但样品量不超过1g。)$$将样品或样品和坩埚置于500ml蒸馏烧瓶中，加4－5粒玻璃珠，加入10ml新鲜制备的NaHCO3溶液，10ml乙醇和0.4ml二硝基氟苯〔DNFB〕塞好塞子，机械振摇3h以上，用6N HCl〔约2ml〕小心酸化，于40℃真空旋转蒸发器中蒸发至油状干燥物。缓缓泄放真空，防止搅动残渣，加50－75ml无水乙醚，倾泻，于40℃在旋转蒸发器中不抽真空再次干燥，重复用醚洗涤并蒸发3次。$$加入约125ml 6N HCl，小心加热直至所有CO2赶去，然后煮沸回流18h，保持水泵恒流或经毛细管预先纯化的氮气通入溶液表面约2.5cm处。冷却1h，并洗下冷凝器上的残渣，于40℃真空旋转蒸发器中蒸发至粘膏状物，再加入100ml H2O并蒸发4次，最后蒸发至干。
D 无DNFB的蛋白质水解物的制备
E 测定
吸取pH2.2的柠檬酸钠缓冲液100ml至带塞烧瓶中，塞上，振摇5min，经滤纸滤至贮瓶中，将蛋白质含量为0.72－0.88mg/ml的滤液1.0ml加到12cm柱上，在每个样品的NH3峰出来后，用再生试剂再生，并用含2%正丙醇的柠檬酸钠缓冲液平衡。$$用赖氨酸或标准的校正混合物在与分析样品相同的条件下分析比较确定赖氨酸峰。$$测定赖氨酸曲线下的峰面积或用积分仪测定峰面积，将样品的峰面积与校正标准物含有已知浓度的赖氨酸〔即2.500±0.04μm/ml 0.1N HCl〕的峰面积进行比较。$$从未经DNFB处理过的样品的赖氨酸的百分含量减去DNFB处理过的样品中赖氨酸的百分含量计算出有效赖氨酸的百分含量。
