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食品、食品和饲料成分中的色氨酸
维生素和其它营养物
- 离子交换色谱法
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A 原理
蛋白质在4.2N NaOH介质中发生水解作用。调节pH和澄清后，色氨酸用离子交换色谱法进行分离，并加入生色团水合茚三酮来测量；或者用反相液相色谱法进行分离后用紫外检测器检测。
B 仪器
B.a 氨基酸分析器
Dionex D-500。色谱柱，50cm×1.75mm〔内径〕不锈钢，内充DC5A阳离子交换树脂。操作条件：流速8ml/h。柱温：先在0－50min期间保持在59℃，然后升到65℃，并在50－90min期间保持。泵入再生剂0.2N NaOH，从0－5.35min。洗脱缓冲液：柠檬酸钠洗脱缓冲液1，pH4.25，0.2N，用于5.35－50 min；然后是柠檬酸钠洗脱缓冲液2，pH5.3，0.14N，含有4%异丙醇，用于50－90min。
B.b 改进的微量克氏烧瓶
25ml微量克氏烧瓶配备有12mm〔内径〕×15cm长颈。将颈缩小到约6mm内径，高于烧瓶圆球5cm。
B.c 液相色谱系统
Waters 6000仪器。柱：25cm×4.6mm〔内径〕不锈钢，μBondapak C^^18^^填充料。操作条件：流速1.5ml/min；流动相：0.0085M NaOAc〔用HOAc调节到pH4.0〕－MeOH(95+5)；紫外检测器，在280nm满量程为0.01吸光度单位。
B.d 真空泵
能达到10μm。
B.e 膜过滤器
0.45μm。
C 试剂
C.a 水
经过纯化的水。
C.b 色氨酸标准溶液
C.b.1 贮备液
1mg/ml。溶解250mgL-色氨酸于100ml水中，加6滴HCl，再加3滴缓冲液起防腐作用，用水稀释至250ml。
C.b.2 工作溶液Ⅰ
0.1mg/ml。将10ml贮备液用水稀至100ml。
C.b.3 工作溶液Ⅱ
0.04mg/ml。用水将4ml贮备液稀至100ml。工作溶液不用时要在冰箱中保存，每月配制一次。
C.c 柠檬酸钠进料缓冲液
pH4.25，0.2N。通过0.45μm膜过滤器过滤两次。
C.d 柠檬酸钠洗脱缓冲液
pH5.3，0.14N，4%异丙醇。262ml pH4.95的缓冲液和40ml异丙醇用水稀释至1L。通过0.45μm膜过滤器过滤两次。
C.e 再生液
0.2N NaOH，加有EDTA。溶解32g NaOH和3g Na2EDTA于水中并用水稀至4L。通过0.45μm膜过滤器过滤两次。
D 样品的制备
在离心式碾磨机中将试样碾碎并通过1mm筛，混合均匀。称取一份含100mg蛋白质的试样〔小于等于300mg〕放入改进的微量克氏烧瓶中。
D.a 含脂类>5%的试样
加10ml石油醚到盛有已称重试样的烧瓶中，轻轻转动使之混合并超声处理20min。静置，如要需要可离心。尽可能多的将石油醚虹吸掉，但要小心不要带走固体。在缓慢的氮气流下将剩余的石油醚蒸发掉。以下的步骤按下述的“水解产物的制备”继续往下做。
D.b 含脂类<5%的试样
按下述的“水解产物的制备”操作。
E 水解产物的制备
通氮10min使4.2N NaOH脱除空气。加10ml脱气的4.2N NaOH到每个烧瓶中，加3滴1-辛醇。立即在干冰-乙醚浴中冷冻处理溶液。然后将烧瓶从冰浴中取出，抽真空至10μm。关掉真空泵，用双头氧/天然气火焰将烧瓶颈收缩封口。将封口的烧瓶放入盛水的烧杯中，置于室温下直至样品熔融。再把烧瓶放入110℃的烘箱中20h。$$待烧瓶冷却至室温，用玻璃刀在每个烧瓶的颈上划一道刀痕，用白热的玻璃棒接触该刀痕使瓶颈封口裂开。轻轻拍打瓶颈使尖端断裂掉入干净的50ml烧杯中。用1ml pH4.25的柠檬酸钠缓冲液淋洗瓶颈，将淋洗液收集在烧杯里。定量转移水解产物到同一个50ml烧杯里，用2ml pH4.25的柠檬酸钠缓冲溶液淋洗烧瓶，共洗两次。用3.5ml HCl在剧烈搅动下中和溶液，调节pH至4.25±0.05。$$定量将溶液转移到25ml容量瓶中，用水稀至刻度。倒入40ml离心管中，在1150r/min离心20min。用玻璃纤维纸过滤上层清液。将滤液转移到离心管中并在23000r/min离心10min。
F 测定
进样40μl试液可标液到氨基酸分析器中，按厂家的说明书操作系统。在系统运行的开始和结束以及每测定5到6个试液后都要进样标准液。$$对液相色谱，进样1.5μl试液或标液进行分离，在280nm测量吸光度A。
G 计算
测量试样和标液中色氨酸的峰面积，按下式计算色氨酸%：$$色氨酸，g/100g＝[(PA/PA')×C×(V/W)]×100$$式中PA和PA'分别为样品和标准的峰面积，C＝g标准/ml，V＝最后稀释的体积，ml；W＝样品重量，g。
