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食品和饲料成分中的含硫氨基酸
维生素和其它营养物
- 离子交换色谱法
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A 原理
蛋白质用过甲酸氧化生成磺基丙氨酸和磺基蛋氨酸,然后在6N HCl介质中水解,用离子交换色谱法测定。
B 仪器和试剂
B.a 过甲酸
加1体积的30%H2O2和9体积的88%甲酸到带玻璃塞的锥形瓶中。混合物在室温下静置1h,时而摇动几下。1h后把瓶子放在冰浴中30min。使用前现配。
B.b 柠檬酸钠进样缓冲液
pH2.2,0.2N,溶解并混和176.6g柠檬酸钠的二水化全物,180ml2,2'-二羟基二乙硫和140ml 6N HCl:加36滴“pHix”缓冲防腐剂。用6N HCl调节pH至2.2±0.05并用水稀至9L。通过0.45μm膜过滤器过滤两次。
B.c 柠檬酸钠洗脱缓冲液Ⅰ
pH2.85,0.17N。溶解并混和16.67g柠檬酸钠的二水化合物,50ml 1-丙醇,5ml2,2'-二羟基二乙硫,4滴“pHix"缓冲防腐剂以及10ml浓HCl。用6N HCl调节pH至2.85±0.02并用水稀至1L。通过0.45μm膜过滤器过滤两次。
B.d 柠檬酸钠洗脱缓冲液Ⅱ
pH4.25,0.2N。通过0.45μm膜过滤器过滤两次。
B.e 磺基丙氨酸-磺基蛋氨酸标准液
2.5μmol/ml。溶解并混合93.6mgL-磺基丙氨酸90.6mgL-磺基蛋氨酸以及1滴“pHix”缓冲防腐剂;用水稀至200ml。
B.f 正亮氨酸内标液
B.f.1 贮备液
10μmol/ml。溶解0.328mg正亮氨酸于水中并稀至250ml。
B.f.2 工作液
1.5μmol/ml。用水将75ml贮备液稀释至500ml。
B.g 氨基酸混合标准液
溶解1.77gL-天冬氨酸,0.40gL-苏氨酸,0.53gL-丝氨酸,0.58gL-缬氨酸,0.66gL-异亮氨酸,1.32gL-亮氨酸,0.38g甘氨酸和0.45gL-丙氨酸于水中并稀至1L。
B.h 氨基酸分析器
DionexD-500。色谱柱,50cm×1.75mm〔内径〕不锈钢,内填充D-5A阳离子交换树脂。流速:8ml/h。柱温:48℃,磺基蛋氨酸洗脱后上升到52℃。洗脱缓冲液:柠檬酸钠洗脱缓冲液1,0.17N,pH2.85,磺基蛋氨酸洗脱后改用柠檬酸钠洗脱缓冲液Ⅱ,0.2N,pH4.25,直至分析结束。检测器,在570nm满量程偏转为0.2A。
C 样品的制备
在Brinkmann研磨机中研磨样品并通过1mm筛,混和均匀。称量含有7.2-25mg蛋白质的样品〔不要大于75mg〕放入125ml长颈烧瓶中,每个样品做两份。移取2.00ml磺基丙氨酸-磺基蛋氨酸标液到各个125ml长颈烧瓶中。在真空旋转蒸发器中于37℃下蒸发至干。
D 氧化水解产物的制备
将含有样品和标准的烧瓶放入冰浴30min。分别加入10ml冷的过甲酸,不要摇动塞好瓶塞,在冰浴中放置16h。$$往每个烧瓶中加入3ml 48%HBr和3滴1-辛醇,转动,竖放在冰浴中30min。在真空旋转蒸发器中在37℃下蒸发至干。将烧瓶接至真空歧管抽真空至<25mmHg,大于等于15min或直至完全干燥。从歧管上取下烧瓶,加入15ml 6N HCl,通入干燥的氮气1min,塞好塞子,放入烘箱中于110±0.5℃下放置18h。$$待烧瓶冷却,加入4.0ml内标工作液,8ml水和3滴1-辛醇,在真空旋转蒸发器中低于50℃蒸发至干。重复加8ml水和蒸发操作两遍。加入15ml柠檬酸钠进样缓冲液并在轨道摇动器上摇动30min。用2N NaOH调节pH至2.2±0.05。往含有磺基丙氨酸-磺基蛋氨酸标液的烧瓶中加入1.5ml氨基酸混合标准液。定量转移样品和标准到25ml容量瓶中,用柠檬酸钠进样缓冲液淋洗烧瓶并稀至刻度。通过玻璃纤维滤纸过滤样品和标准液,将滤液转移到离心管中,在15000r/min转速下离心5min。
E 测定
进样40μl样品或标准液到氨基酸分析器的样品接受单元。操作氨基酸分析器,进样磺基丙氨酸-磺基蛋氨酸标液。调整色谱操作条件,要求使磺基蛋氨酸的峰能达到大于90%分离度。进样样品和标准,在每测定5个样品和在每组样品的测定前后进样标准。
F 计算
测量样品和标准中的磺基丙氨酸和磺基蛋氨酸的峰面积或峰高。计算磺基丙氨酸和磺基蛋氨酸的响应因子Kc/Km。$$Kc=〔内标的峰面积/磺基丙氨酸的峰面积〕×(0.20μmol/ml×25ml×分子量×100)$$用同样方式计算蛋氨酸的响应因子(Km)。对磺基丙氨酸,分子量用121.2μg/μmol。对磺基蛋氨酸用149.2μg/μmol。$$计算:%巯基丙氨酸$$%巯基丙氨酸=(Kc×磺基丙氨酸峰面积)/〔内标峰面积×样品重(mg)×1000μg/mg〕$$同样,用Km计算%蛋氨酸。