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多成分食物中的胆固醇
维生素和其它营养物
- 气相色谱法
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A 原理
用混合溶剂从样品中提取类脂质并皂化，含有胆固醇及其它固醇的不皂化物用苯提取，固醇经衍生化生成三甲基硅〔TMS〕醚，以5α-胆甾烷作内标；用气相色谱仪测定含量。
B 仪器
B.a 离心管
15ml。按下述方法硅烷化管子：用无水MeOH洗干净的管子，于110℃干燥30min，保存在干燥器中，用10%二甲基二氯硅烷的甲苯溶液充满管子，塞好塞子，放置1h，倒掉溶液并用无水MeOH彻底清洗管子。用前在110℃烘箱中干燥。使用后，用MeOH，H2O及MeOH依次洗涤管子。用前在110℃烘箱中干燥管子，只要避免用强碱洗，管子可以反复使用而不必再硅烷化。
B.b 气相色谱仪
配备氢火焰离子化检测器、柱头进样系统、和填充0.5%Apiezon L/80－100目Gas-Chrom Q的U型玻璃柱(2.4m×3mm内径)或填充1%SE-30于100－120目Gas-Chrom Q的U型玻璃柱(1.8m×4mm内径)。操作条件：温度〔℃〕－快速加热器275，检测器275，柱230，流速(ml/min)－NC〔超高纯级〕约50，于9－11min洗脱胆固醇，H2约35，空气350，电流计灵敏度1×10^-9^安培，记录仪满刻度为1mV。
B.c 均化器
350ml广口螺旋帽盖子。
B.d 磁搅拌加热板
带变速加热控制器。
B.e 旋转蒸发器
在浓缩瓶和金属轴之间有玻璃冷凝瓶。
B.f 试管混合器。
C 试剂
C.a 胆固醇标准液
标准胆固醇。
C.a.1 贮备液
1.0mg/mlDMF液。
C.a.2 工作溶液
用DMF稀释贮备液，使其浓度范围自0.05至0.5mg/ml。
C.b 5α-胆甾烷内标溶液
标准5α-胆甾烷
C.b.1 贮备液
1.0mg/ml正庚烷溶液
C.b.2 工作溶液
0.2mg/ml，用正庚烷稀释贮备液使其浓度为0.2mg/ml。
C.c 二甲基二氯硅烷。
C.d 二甲基甲酰胺
玻璃容器中蒸馏。
C.e 玻璃棉
硅烷化处理。
C.f 正庚烷
玻璃容器中蒸馏。
C.g 六甲基二硅胺〔HMDS〕。
C.h 浓KOH溶液
溶解60g KOH于40ml H2O中。
C.i 醇类试剂
EtOH-MeOH-异丙醇(90+5+5)。
C.j 甲苯
毫微级，玻璃容器中蒸馏。
C.k 三甲基氯硅烷〔TMCS〕。
C.l 三甲苯硅烷〔TMS〕试剂
HMDS-TMCS-吡啶(9+6+10)。
C.m 吸附剂
硅藻土545，酸洗。通常适用于柱色谱法，当存在干扰物时，按下述方法纯化：将玻璃棉填料置于色谱管底部〔管径大于等于100mm〕加硅藻土，高度约为直径的5倍，加相当于硅藻土1/3体积的HCl，使其渗滤。先用少量MeOH冲洗管壁，然后再用MeOH淋洗直至洗液对湿润的指示剂试纸呈中性。淋洗好的硅藻土剂入浅底碟中，在蒸汽浴上加热除去MeOH，再在105℃干燥至物料成粉状且无MeOH，在密闭容器内贮存。
D 气相色谱柱的制备及装填
连接空柱与吸气泵并抽入5%HF溶液，停泵用夹子切断真空，用胶塞迅速塞住两头，让柱充满5%HF溶液，放置10min。$$再将柱连接到吸气泵，用约150ml H2O冲洗，再用150ml无水MeOH洗，最后用150ml异辛烷洗，通过抽气将柱干燥，用吸气泵慢慢抽TMS试剂〔1〕至充满柱子。将柱两端塞住，放置30min，将TMS试剂抽出并立即用100ml无水MeOH冲洗，接着用200ml异辛烷洗涤柱子，将柱真空干燥。$$用已制备好的商品柱〔填充5%Apiezon L于80－100目Gas-Chrom Q上〕。或按下述方法制备：称取0.5g Apiezon L于100ml烧杯中，加入80ml甲苯，电磁搅拌至完全溶解，移入500ml锥形瓶中，每次用5ml甲苯洗涤烧杯4次，称取10g 80－100目的Gas-Chrom Q加到Apiezon L溶液中，加塞摇动便成糊状，立即在抽真空情况下倒入布氏型烧结玻璃滤器〔中孔〕，连续搅拌直至排出全部液体，用量筒量取滤液并测定Apiezon L的吸附量。在真空条件下放置偶而搅动直至近干燥，将填料移入瓷蒸发皿中于110－120℃烘箱干燥完全，贮于玻璃瓶中备用。$$将填料在100℃烘箱中加热15min用6mm硅烷化玻璃棉塞住硅烷化柱接检测器的一端，并联接到抽气泵上，将温热填料经漏斗加入柱中，并轻轻敲击柱子，最后用硅烷化玻璃棉塞好进样口端，于235℃通氮气老化柱子24h。
E 水分测定
准确称取约5.0g样品至称重过重量的铝皿中，置于循环型100℃空气烘箱中干燥过夜，或在110℃干燥3h。加盖于干燥器冷却，准确称量，并测定其水份含量，以调节需加入的水量。
F 类脂的提取
F.a 除了干全蛋固体，蛋黄酱及脱脂奶粉以外的食品
取100ml CHCl3-类脂提取液经铺有小块玻璃棉及装约25gNa2SO4的玻璃漏斗滤入150ml烧杯中，用15ml CHCl3洗涤Na2SO4并在90℃水浴或蒸汽浴上缓缓通氮气蒸发至干，将残留物溶于约70ml石油醚中，并经盛有20g无水Na2SO4的Whatman 1号滤纸过滤至300ml玻塞锥形瓶中，用石油醚洗涤烧杯及Na2SO4数次，每次10ml，在氮气流下于蒸汽浴上蒸干。$$将磁搅拌棒放入锥形烧瓶中，并置于磁搅拌器电热板上，轻轻搅拌慢慢加入8ml浓KOH溶液(h)，及40ml试剂醇(i)，联接冷凝管，开启搅拌及电热，回流溶液1h，关掉电热，在搅拌并冷却情况下经冷凝管加入60ml试剂醇于皂化液中，当样品停止回流时，取下冷凝管，在缓慢搅拌下吸取100ml苯放至样品，取出搅拌棒，塞好瓶塞，猛烈振摇30s。$$倒入500ml分液漏斗中不加洗涤，加入200ml 1N KOH并猛烈振摇10s，任其分层，弃去水层〔下层，呈混浊〕用40ml 0.5N KOH洗涤苯层。缓缓颠倒转动分液漏斗10s，弃去水层〔下层〕，将苯层浸入250ml分液器中，加40ml水，颠倒转动分液器10次，以反洗苯层，再重复用水洗涤至少3次，最后水洗液的pH值应为7，从分液漏斗顶部倒出苯提取液，经铺有约15g无水Na2SO4的4号Whatman滤纸滤入125ml玻塞锥形瓶中，加入约20g无水Na2SO4，塞好，并猛烈振摇，放置15min。$$吸取50ml样品放入100ml圆底玻塞烧瓶中，在旋转蒸发器上于40℃蒸发至干，加入3ml丙酮，再次蒸干，溶解残渣于3ml DMF。
F.b 干全蛋固体
取100ml CHCl3-类脂提取液经铺有小块玻璃棉及装约25gNa2SO4的玻璃漏斗滤入150ml烧杯中，用15ml CHCl3洗涤Na2SO4并在90℃水浴或蒸汽浴上缓缓通氮气蒸发至干，将残留物溶于约70ml石油醚中，并经盛有20g无水Na2SO4的Whatman 1号滤纸过滤至300ml玻塞锥形瓶中，用石油醚洗涤烧杯及Na2SO4数次，每次10ml，在氮气流下于蒸汽浴上蒸干。$$将磁搅拌棒放入锥形烧瓶中，并置于磁搅拌器电热板上，轻轻搅拌慢慢加入8ml浓KOH溶液(h)，及40ml试剂醇(i)，联接冷凝管，开启搅拌及电热，回流溶液1h，关掉电热，在搅拌并冷却情况下经冷凝管加入60ml试剂醇于皂化液中，当样品停止回流时，取下冷凝管，在缓慢搅拌下吸取100ml苯放至样品，取出搅拌棒，塞好瓶塞，猛烈振摇30s。$$倒入500ml分液漏斗中不加洗涤，加入200ml 1N KOH并猛烈振摇10s，任其分层，弃去水层〔下层，呈混浊〕用40ml 0.5N KOH洗涤苯层。缓缓颠倒转动分液漏斗10s，弃去水层〔下层〕，将苯层浸入250ml分液器中，加40ml水，颠倒转动分液器10次，以反洗苯层，再重复用水洗涤至少3次，最后水洗液的pH值应为7，从分液漏斗顶部倒出苯提取液，经铺有约15g无水Na2SO4的4号Whatman滤纸滤入125ml玻塞锥形瓶中，加入约20g无水Na2SO4，塞好，并猛烈振摇，放置15min。$$吸取50ml样品放入100ml圆底玻塞烧瓶中，在旋转蒸发器上于40℃蒸发至干，加入3ml丙酮，再次蒸干，溶解残渣于3ml DMF。
F.c 蛋黄酱
取100ml CHCl3-类脂提取液经铺有小块玻璃棉及装约25gNa2SO4的玻璃漏斗滤入150ml烧杯中，用15ml CHCl3洗涤Na2SO4并在90℃水浴或蒸汽浴上缓缓通氮气蒸发至干，将残留物溶于约70ml石油醚中，并经盛有20g无水Na2SO4的Whatman 1号滤纸过滤至300ml玻塞锥形瓶中，用石油醚洗涤烧杯及Na2SO4数次，每次10ml，在氮气流下于蒸汽浴上蒸干。$$将磁搅拌棒放入锥形烧瓶中，并置于磁搅拌器电热板上，轻轻搅拌慢慢加入8ml浓KOH溶液(h)，及40ml试剂醇(i)，联接冷凝管，开启搅拌及电热，回流溶液1h，关掉电热，在搅拌并冷却情况下经冷凝管加入60ml试剂醇于皂化液中，当样品停止回流时，取下冷凝管，在缓慢搅拌下吸取100ml苯放至样品，取出搅拌棒，塞好瓶塞，猛烈振摇30s。$$倒入500ml分液漏斗中不加洗涤，加入200ml 1N KOH并猛烈振摇10s，任其分层，弃去水层〔下层，呈混浊〕用40ml 0.5N KOH洗涤苯层。缓缓颠倒转动分液漏斗10s，弃去水层〔下层〕，将苯层浸入250ml分液器中，加40ml水，颠倒转动分液器10次，以反洗苯层，再重复用水洗涤至少3次，最后水洗液的pH值应为7，从分液漏斗顶部倒出苯提取液，经铺有约15g无水Na2SO4的4号Whatman滤纸滤入125ml玻塞锥形瓶中，加入约20g无水Na2SO4，塞好，并猛烈振摇，放置15min。$$吸取50ml样品放入100ml圆底玻塞烧瓶中，在旋转蒸发器上于40℃蒸发至干，加入3ml丙酮，再次蒸干，溶解残渣于3ml DMF。
F.d 脱脂奶粉
取100ml CHCl3-类脂提取液经铺有小块玻璃棉及装约25gNa2SO4的玻璃漏斗滤入150ml烧杯中，用15ml CHCl3洗涤Na2SO4并在90℃水浴或蒸汽浴上缓缓通氮气蒸发至干，将残留物溶于约70ml石油醚中，并经盛有20g无水Na2SO4的Whatman 1号滤纸过滤至300ml玻塞锥形瓶中，用石油醚洗涤烧杯及Na2SO4数次，每次10ml，在氮气流下于蒸汽浴上蒸干。$$将磁搅拌棒放入锥形烧瓶中，并置于磁搅拌器电热板上，轻轻搅拌慢慢加入8ml浓KOH溶液(h)，及40ml试剂醇(i)，联接冷凝管，开启搅拌及电热，回流溶液1h，关掉电热，在搅拌并冷却情况下经冷凝管加入60ml试剂醇于皂化液中，当样品停止回流时，取下冷凝管，在缓慢搅拌下吸取100ml苯放至样品，取出搅拌棒，塞好瓶塞，猛烈振摇30s。$$倒入500ml分液漏斗中不加洗涤，加入200ml 1N KOH并猛烈振摇10s，任其分层，弃去水层〔下层，呈混浊〕用40ml 0.5N KOH洗涤苯层。缓缓颠倒转动分液漏斗10s，弃去水层〔下层〕，将苯层浸入250ml分液器中，加40ml水，颠倒转动分液器10次，以反洗苯层，再重复用水洗涤至少3次，最后水洗液的pH值应为7，从分液漏斗顶部倒出苯提取液，经铺有约15g无水Na2SO4的4号Whatman滤纸滤入125ml玻塞锥形瓶中，加入约20g无水Na2SO4，塞好，并猛烈振摇，放置15min。$$吸取50ml样品放入100ml圆底玻塞烧瓶中，在旋转蒸发器上于40℃蒸发至干，加入3ml丙酮，再次蒸干，溶解残渣于3ml DMF。
G 未皂化部分的皂化与提取
取100ml CHCl3-类脂提取液经铺有小块玻璃棉及装约25gNa2SO4的玻璃漏斗滤入150ml烧杯中，用15ml CHCl3洗涤Na2SO4并在90℃水浴或蒸汽浴上缓缓通氮气蒸发至干，将残留物溶于约70ml石油醚中，并经盛有20g无水Na2SO4的Whatman 1号滤纸过滤至300ml玻塞锥形瓶中，用石油醚洗涤烧杯及Na2SO4数次，每次10ml，在氮气流下于蒸汽浴上蒸干。$$将磁搅拌棒放入锥形烧瓶中，并置于磁搅拌器电热板上，轻轻搅拌慢慢加入8ml浓KOH溶液(h)，及40ml试剂醇(i)，联接冷凝管，开启搅拌及电热，回流溶液1h，关掉电热，在搅拌并冷却情况下经冷凝管加入60ml试剂醇于皂化液中，当样品停止回流时，取下冷凝管，在缓慢搅拌下吸取100ml苯放至样品，取出搅拌棒，塞好瓶塞，猛烈振摇30s。$$倒入500ml分液漏斗中不加洗涤，加入200ml 1N KOH并猛烈振摇10s，任其分层，弃去水层〔下层，呈混浊〕用40ml 0.5N KOH洗涤苯层。缓缓颠倒转动分液漏斗10s，弃去水层〔下层〕，将苯层浸入250ml分液器中，加40ml水，颠倒转动分液器10次，以反洗苯层，再重复用水洗涤至少3次，最后水洗液的pH值应为7，从分液漏斗顶部倒出苯提取液，经铺有约15g无水Na2SO4的4号Whatman滤纸滤入125ml玻塞锥形瓶中，加入约20g无水Na2SO4，塞好，并猛烈振摇，放置15min。$$吸取50ml样品放入100ml圆底玻塞烧瓶中，在旋转蒸发器上于40℃蒸发至干，加入3ml丙酮，再次蒸干，溶解残渣于3ml DMF。
H 胆固醇标准品的衍生化及气相色谱校正
取每个胆固醇工作标准溶液[G(a)(2)]1ml至15ml的硅烷化处理的离心管。〔保持DMCS-硅烷化离心管清洁干燥〕加入0.2ml HMDS及0.1ml TMCS，塞好，在试管混合器(f)上猛烈振摇，或用手摇30s，任其静置15min，加入1.0ml 5α-胆甾烷内标工作溶液[C(b)(2)]及10ml H2O至管中，猛烈振摇1min，并离心2min。$$将平行两份3μl或另外适当体积〔对全部标准及样品应以相同体积进样〕的庚烷液至气相色谱仪，调整仪器参数，使5α-胆甾烷保留时间约为5min，而胆固醇的保留时间约10分钟。用测量峰高-峰宽或数字积分仪测定每个峰的面积。用胆固醇的峰面积除以内标峰面积，求得标准响应值比。将两份结果平均，以平均响应值比(y-轴)对胆固醇浓度(mg/ml)(x-轴)作图。样品响应值比应在标准响应值比的范围内。
I 样品的衍生化与分析
取每个胆固醇工作标准溶液[G(a)(2)]1ml至15ml的硅烷化处理的离心管。〔保持DMCS-硅烷化离心管清洁干燥〕加入0.2ml HMDS及0.1ml TMCS，塞好，在试管混合器(f)上猛烈振摇，或用手摇30s，任其静置15min，加入1.0ml 5α-胆甾烷内标工作溶液[C(b)(2)]及10ml H2O至管中，猛烈振摇1min，并离心2min。$$将平行两份3μl或另外适当体积〔对全部标准及样品应以相同体积进样〕的庚烷液至气相色谱仪，调整仪器参数，使5α-胆甾烷保留时间约为5min，而胆固醇的保留时间约10分钟。用测量峰高-峰宽或数字积分仪测定每个峰的面积。用胆固醇的峰面积除以内标峰面积，求得标准响应值比。将两份结果平均，以平均响应值比(y-轴)对胆固醇浓度(mg/ml)(x-轴)作图。样品响应值比应在标准响应值比的范围内。
