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乳基婴儿方便食品配方中的维生素B6
维生素和其它营养物
- 微生物测定法
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A 试剂
〔所有含维生素B6的溶液都需在柔和光线下操作〕
A.a 维生素溶液Ⅰ
将10mg硫胺素和1g肌醇溶解在约200ml水中并稀释至1L，贮存于冰箱中(1ml＝10μg硫胺素和1mg肌醇〕
A.b 维生素溶液Ⅱ
将10mg生长素溶于100ml 50%乙醇中，在冰箱中贮存，(1ml＝100μg生长素〕。将200mg泛酸钙和200mg烟酸溶解在约200ml水中。加8ml生长素溶液用水稀至1L，在冰箱中贮存。(1ml＝200μg泛酸钙、200μg烟酸和0.8μg生长素〕。
A.c 盐溶液Ⅰ
将17g KCl、10.3g MgSO4·7H2O、100mg FeCl3·6H2O和100mg MnSO4·H2O溶解在约800ml水中。加入2ml盐酸。将5g CaCl2·2H2O溶解在约100ml水中，加入到上述溶液中，用水稀释至1L在冰箱中贮存。(1ml＝17mg KCl、10.3mgMgSO4·7H2O。100μg FeCl3·6H2O，100μg MnSO4·H2O和5mg CaCl2·2H2O)。
A.d 盐溶液Ⅱ
将22gKH2PO4和40g (NH4)2HPO4溶解在水中并稀释至1L。贮存于冰箱中。(1ml＝22mg KH2PO4和40mg (NH4)2HPO4)。
A.e 多乙氧基醚溶液
称取2.5g多乙氧基醚〔吐温80〕于小烧杯中，用温热水〔45℃〕转移并稀释至500ml。在冰箱中贮存。(1ml＝5mg多乙氧基醚)
A.f 柠檬酸溶液
(1+1)。将50g柠檬酸溶解在50ml水中，置于带塑料盖子的瓶中于室温贮存。
A.g 磷酸铵溶液
(1+2)。将25g(NH4)2HPO4溶解在50ml水中，置于带塑料盖子的瓶中于室温贮存。
A.h 吡哆素标准溶液：
A.h.1 贮备液
10.0μg/ml。将12.16mg盐酸吡哆素溶解在1N盐酸中并用其稀释至1L。置于玻璃瓶中于冰箱中贮存。
A.h.2 中间溶液
100ng/ml。用水将5ml贮备液稀释至500ml。每次分析新鲜制备。
A.h.3 工作溶液
1.0ng/ml，用水将5ml中间溶液稀释至500ml并混匀，每次分析新鲜制备。
A.i 柠檬酸盐缓冲液：
将65gKOH和82g柠檬酸溶解在水中，并稀释至1L。
A.j 基础培养基贮备液〔为200管用〕
制备成1L基质。将100ml柠檬酸盐缓冲液、2g天冬酰胺、50ml维生素溶液Ⅰ、50ml维生素溶液Ⅱ、50ml盐溶液Ⅰ、50ml盐溶液Ⅱ、加至约400ml水中。将100mg葡萄糖溶解在该溶液中，将22mgDL-色氨酸、27mgDL-组氨酸盐酸液、100mgDL-甲硫氨基酸、216mgDL-异亮氨酸和256mgDL-缬氨酸置于小烧杯中，使其溶解在10ml盐酸(1+9)中。可将该溶液加入到前述溶液中，加入20ml多乙氧基醚溶液。用柠檬酸(1+1)或(NH4)2HPO4(1+2)溶液调节pH至4.5。用水稀释至1L。将该溶液置于用棉花塞住的硬质玻璃瓶中，存放于冰箱。使用前24h时制备。
A.k 试验生物体
酵母菌属Saccharomyces uvarum(ATCC No.9080)保持每周在麦芽汁琼脂斜面〔I〕上接种。并于30℃培养24h，再冷冻。
A.l 琼脂培养基
将25g琼脂悬浮在装有约400ml水的标有500ml刻度的广口锥形瓶中。盖上防止污染。用蒸汽加热约10min使琼脂溶解，调节体积至500ml。移取热的琼脂每份约7ml至20×150mm的各试管中，用脱脂棉塞塞上，于121℃高压釜消毒15min。因为此培养基有酸反应，故避免过热。过热将造成培养基变软。使热琼脂试管倾斜以形成斜面，并在此位置冷却。
A.m 液体培养基
在容量瓶中将20ml中间溶液[(h)(2)]稀释至1L。称取5ml该溶液和5ml基础培养基贮备液(j)至装有二粒4mm玻璃小珠的16×150mm具有螺旋帽的试管中。于121℃高压釜灭菌10min，在冰箱中贮存。
A.n 接种冲洗液
移取5ml水和5ml基础培养基贮备液至带有不锈钢帽或螺旋帽的16×150mm试管中。在121℃高压釜灭菌10min。
B 测定接种液
使用前将接种在琼脂上的细胞于30℃培养24h。在无菌条件下，将这些细胞转种到液体培养基的试管中，将试管置于振荡器，上在30℃摇动20h，或放在机械摇动的水浴上〔30℃〕20h。在250r/min下离心1.5min。倾出上清液，再用10ml接种淋洗液重新悬浮，在2500r/min下离心1.5min进行分离，再倾出上清液，再用第二个10ml接种淋洗液重新悬浮，离心1.5min。再倾出清液，再用第三个10ml无菌接种淋洗液重新悬浮。取第三个悬浮液1ml加至10ml接种淋洗液中，该液便是测定接种液。
C 样品的制备
称量10.0g混合物至500ml锥形瓶中。加入200ml 0.05N HCl，于121℃高压釜加热5h、冷却至室温且用6N KOH调节pH至4.5。将该溶液定量转移至250ml容量瓶中，用水稀释定容。通过Whatman 40号滤纸过滤，用水将1ml此滤液稀释至20ml，这便是测定液。
D 测定
将装有两粒4mm玻璃珠的且带有螺旋帽的16×150mm试管于260℃加热2h，绘制标准曲线：在各试管中，分别吸取0.0,0.0,1.0,2.0,3.0,4.0和5.0ml吡哆素工作液[(h)(3)]，一式三份。同样地吸取1.0,2.0,3.0和4.0ml测定液至各试管中，一式两份。加H2O至上述各试管中，使每管内溶液为5ml。向各管分别加入5ml基础培养基贮备液(j)，使每支试管总溶液体积为10ml。将所有试管加盖，在121℃高压釜加热10min，用水浴或冰箱冷却至室温。除了第一组0.0水平的用于标准曲线外，其它的各支都用一滴测定接种液无菌接种。接种的各试管置于恒定往复式摇床上，调节恒定室温〔30℃〕条件下培养22h，或在机械水浴摇床上于30℃培养22h。在高压釜中蒸汽加热5min，冷却，用分光光度计在550nm波长读透光度%T。用水设定100%T，以读出未接种空白，用未接种的空白设定100%T，读出接种空白。将三支接种空白试管混合，用这混合物设定100%T，读出其余所有试管的透光度%T。$$将一式三份试管的读数平均，以其%T对每个标准溶液中吡哆素的量ng在半对数坐标纸上作图绘制曲线。用内插法确定每管样品中吡哆素的量。计算吡哆素量μg/g样品。
