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乳剂婴儿食品配方中钴胺素〔活性维生素B12〕
维生素和其它营养物
- 比浊法
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A 基础培养基贮备液
A.a 腺嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶溶液
分别将1.0g腺嘌呤硫酸盐、鸟嘌呤盐酸盐和尿嘧啶溶解在50ml温热的HCl中(1+1)。冷却，用H2O稀释至1L。
A.b 天冬酰胺溶液
将10gL-天冬酰胺溶解在H2O中，并稀释至1L。
A.c 多乙氧基醚溶液
将25g多乙氧基醚〔聚氧乙烯脱水山梨〔糖〕醇单油酸〕溶解在乙醇中，使之成为250ml。
A.d 盐溶液A
将50g无水KH2PO4和50g无水K2HPO4溶解在H2O中，并稀释至1L。加10滴HCl。
A.e 盐溶液B
将20gMgSO4·7H2O、1gNaCl、1gFeSO4·7H2O和1g MgSO4·H2O溶解在H2O中并稀释至1L。加入10滴HCl。
A.f 维生素溶液Ⅰ
将25mg核黄素、25mg盐酸硫胺素、0.25mg生物素和50mg烟酸溶解在0.02N醋酸中，使成为1L。
A.g 维生素溶液Ⅱ
将50mg对氨基苯甲酸、25mg泛酸钙、100mg盐酸吡哆素、100mg盐酸吡哆醛、20mg盐酸吡哆胺以及5mg叶酸溶解在25%的乙醇中，使成为1L。
A.h 黄嘌呤溶液
将1.0g黄嘌呤悬浮在150－200ml H2O中，加热至约70℃加入30ml NH4OH(2+3)搅拌直至固体溶解，冷却，用水稀释至1L。
A.i 酸水解酪蛋白
市售的无维生素的酸水解酪蛋白。
B 培养液和悬浮培养基
B.a 液体培养基
将15g胨化牛奶、5g水溶酵母提取液、10g无水葡萄糖和2g无水KH2PO4溶解在约600ml水中。加入100ml经过滤的番茄汁并用NaOH溶液调节pH至6.5－6.8，边混合边加入10ml多乙氧基醚溶液，用水稀释至1L。将上述一定量的溶液用含有1ng维生素B12/ml的水等体积稀释。并取每份10ml加入到20×150mm并有细旋盖的各试管中，在高压釜中于121－123℃灭菌15min。迅速冷却并在冰箱中贮存。
B.b 琼脂培养基
向500ml液体培养基(a)中加入5.0－7.0g琼脂、在蒸汽浴上边加热边搅拌，直至琼脂溶解。从中取每份10ml热溶液加到各试管中，加盖以防止污染。在高压釜中于121－123℃灭菌15min。试管在垂直位置让其尽快冷却，保持生成的颜色最浅、在暗处约10℃下贮存。
B.c 悬浮培养基
将一定量合适的基础培养基贮备液〔表24-3〕用等体积的水稀释。将每份10ml稀的培养基加到各试管中，加盖防止污染，在高压釜中于121－123℃灭菌15min。迅速冷却试管，保持形成的颜色最浅。在暗处约10℃贮存。
C 试验生物体的贮备培养液
用制酪乳酸杆菌在一个或许多装有琼脂培养基B(b)的试管中进行穿刺接种培养。在37℃〔恒定温度0.5℃以内〕培养6－24h，最终在暗处于约10℃下贮存。测定时，采用新的培养液前的1至2周中连续地作几次菌种培养转移。一周至少制备一次新鲜穿刺菌种培养。如果穿刺菌种超过一周，则不要用来接种。采取每天或每两天进行菌种穿刺培养的转移，则可以提高菌种缓慢生长的活度，在接种后2－4h能观察到在液体接种培养液中有一定的浊度则被认为是满意的。菌种的缓慢生长很少给出合适的响应曲线且可能会产生错误的结果。
D 测定管
采用合适的方法〔用USP的十二烷基磺酸钠为清洗剂〕。仔细地清洗规格约为20×150mm的硬质玻璃管和其他玻璃器皿，〔由于试验生物体对于小量的生长因素和许多种清洗剂都是高度敏感的，因此可以先在约250度加热1至2h后再清洗〕。$$制备含有标准液的试管如下：向各试管中分别加入0.0〔未接种空白〕，0.0〔作接种空白〕，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0ml标准液。一式两份〔或做重复试验〕。制备含有下述不同数量测定液的试管：向类似的试管中分别加入1.0,2.0,3.0和4.0ml的测定液，一式两份〔或做重复试验〕。向每个含标准液试管和每个含测定液试管加水至体积均为5.0ml，然后加入5.0ml基础培养基贮备液且混匀。盖上试剂盖以防止细菌污染，在高压釜中于121－123℃灭菌10min，达到121－123℃不要超过10min，迅速冷却以使形成的颜色最浅。在整个试验过程中注意保持消毒和冷却条件的均一性〕在高压釜中试管装填的太密或太挤都可能引起加热速度的变化，除了含有0.0ml标准液〔未接种空白〕一组的一式两份〔或重复试验〕的试管外，用一滴接种液向其他各试管进行无菌接种。于37℃〔恒定在0.5℃以内〕培养16－24h，带有任何外来的生物体污染测定试管都会使测定失效。
E 光度计的校正
使用接种液J和贮备液I(a)直接进行下列操作。于无菌条件下将1ml接种液加至含有1ml标准贮备液的约300ml无菌悬浮培养基中， 在F测定中所采用的相同温度和相同周期下培养混合物。在培养后离心并用每份约50ml的0.9%NaCl溶液洗涤细胞共3次，然后在NaCl中再将细胞重新悬浮，使为25ml。$$将细胞悬浮液的10ml置于蒸汽浴上蒸发，在110℃的真空干燥箱中干燥至恒重，扣除NaCl重量，计算每毫升悬浮液中细胞的干重(mg/ml)。$$用0.9%NaCl溶液稀释第二份上述测定的细胞悬浮液一定量，使每ml内含有0.5mg于细胞。向各试管中分别加入这些稀释的细胞悬浮液，分别为0.0〔作空白〕,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,4.0和5.0ml。一式三份，对每一试管再加入0.9%NaOH溶液，使之最终体积都为5ml。然后加入5.0ml基础培养基贮备液，混匀〔可加入一滴合适的消泡剂〕。将其转移至比色池中，用空白设定透光度100%T，在测定中使用相同的条件测量每一试管的透光度%T。以每一种水平的稀释细胞悬浮液的%T读数对每一相应试管中细胞含量(mg干重)作图绘制曲线。$$在测定中使用的光度计重复校正步骤至少应在二次以上。绘制混合曲线，最好代表三条或更多条单独的曲线，在测定条件下光度计的透光度%T和细胞干重mg的关系，一旦特定仪器的上述曲线确定后，所有以后%T与细胞干重间的关系都可从这条曲线直接测得。以mg干细胞重/管表示的测定限量就是这样被测得。
F 测定
培养基于16－24h直至得到最大浊度，可通过对含有最高标准溶液的试管中，再培养2h在培养周期浊度无明显变化得以证实。按下述方法测量试管透光度T：充分混合每一试管内容物〔可加一滴合适的消泡剂溶液〕。并转移至比色池中，搅拌内容物。将比色池置于光度计中，在540－660nm波长间任何特定波长下，达到稳定时读透光度%T，当电流计读数维持恒定值>30s时，在搅拌后3－4s可观察为定态。按照大约相同时间间隔读取每个试管的透光度值。$$以未接种的空白的透光度T为100%，读出接种空白的透光度%T。如果这个读取相应每一试管中细胞干重>0.6mg则弃去测定的结果。然后对接种空白再设T为100%，对每一其他试管读透光度%T，如果5.0ml标准溶液的水平〔对未接种空白〕所得到的%T相对于每支试管中细胞干重<1.25ml/管则弃去测定的结果。以每一浓度标准溶液的%T读数对各相应试管所得的参比标准量作图绘制标准浓度-响应曲线。$$采用内插法从标准曲线测定每一浓度测定液的维生素含量，弃去分别相当于<0.5ml或>4.5ml标准溶液所观察到的透光度T值，按照计算进行。
G 计算
为每一所用的测定液，计算每毫升测定液中维生素含量。从那些与平均值相差小于10%的各试管计算所得到的平均值。如果在四个水平的测定液中，可接受值的数目小于所采用的原始管数的2/3，则用于计算样品效价的数据是不够的。如果可接受值的数目大于所用的原始试管数的2/3，则可从它们的平均值计算样品的效价。
H 基础培养基贮备液
制备每升不含维生素B12双倍于基础培养基浓度的贮备液，按下面所列次序加入：20ml腺嘌呤-鸟嘌呤-尿嘧啶溶液，20ml天冬酰胺溶液，20ml盐溶液A，20ml盐溶液B，40ml维生素溶液Ⅰ，40ml维生素溶液Ⅱ，20ml叶黄素溶液和20ml多乙氧基醚溶液。加H2O至总体积为约800ml，混匀，以防止加料时由沉淀产生的固体物。然后按下列次序加入：10g酸水解酪蛋白，0.4gL-胱氨酸和0.4gDL-色氨酸，一起溶解在最小量的稀HCl中(236ml浓HCl/L)40g葡萄糖，33.2g三水醋酸钠和4g抗坏血酸。加入抗坏血酸后不要猛烈搅动溶液，缓缓摇动直至有有固体溶解。用HCl或NaOH调节pH至6.0，用pH计测定。稀释定容。采用指示剂时，因指示剂可被多乙氧基醚吸附，所以应在调节pH后加入多乙氧基醚溶液。一些市售培养基是适用的。
I 氰钴胺素标准溶液
I.a 贮备液
100ng/ml。在密闭系统中精确称取已干燥至恒重并在暗处贮存于P2O5干燥器中的USP氰钴胺素参比标准50－60μg，溶解于25%乙醇中，并再用25%乙醇稀释，使氰钴胺素的含量恰好为100ng/ml。于暗处约10℃保存。
I.b 工作溶液
将一定量的中间溶液用H2O稀释至500ml，该标准溶液相当于0.01－0.04ng/ml，而且约相当样品制备的测试液浓度。同样，再制备2个辅助标准，一个较高，一个较低〔即0.010和0.020ng/ml〕，为样品中维生素B12的浓度提供宽的工作范围。
J 接种
从制酪乳酸杆菌贮备培养液将细胞转移至盛有10ml液体培养基[B(a)]的2支灭菌管中，保持所有转移尽可能无菌，在37±0.5℃培养6－24h。在无菌条件下，离心培养液并倾出上清液，用约10ml的3份无菌0.9%NaCl溶液或无菌悬浮培养基[B(c)]洗涤细胞。将细胞重新悬浮于10ml无菌0.9%NaCl溶液或无菌悬浮培养基中，用无菌0.9%NaCl溶液或无菌悬浮培养基稀释，使得到的T相当于干细胞重0.50－0.75mg/管〔按E所述〕，此时悬浮培养基的读数设在100%T。这样获得的细胞悬浮液为接种液。
K 测试溶液
使用前制备水提取液：每100ml中含1.3g无水Na2HPO4，1.2g一水柠檬酸和1.0g无水焦亚硫酸钠Na2S2O5。取一定量的样品量使含维生素B12 5－100ng，移至盛有一定量提取液的烧杯中〔在最终测定液浓度为0.01和0.04ng维生素B12/ml之间时〕。使Na2S2O5的含量<0.03mg/ml。$$将样品溶液充分分散于液体中，用H2O冲洗烧杯壁，盖上表面皿，于121－123℃高压釜中加热混合物10min，冷却。如产生块状物，振摇混合物直至颗粒充分分散。边猛烈振摇边调节混合物至pH4.5。用H2O稀释混合物至一定体积，使维生素B12的含量接近0.2ng/ml，并过滤。$$取一定量滤液检查可溶性蛋白，首先滴加稀HCl，如无更多的沉淀生成，按下述方法进行，在猛烈搅拌下用NaOH溶液检查：
K.a
如无更多的沉淀生成，在猛烈搅拌下加NaOH溶液至pH6.0，用H2O稀释至最终测试体积含维生素B12的活度相当于约0.014ng/ml。
K.b
如无更多的沉淀生成，在猛烈搅拌下加NaOH溶液至pH6.0，用H2O稀释至最终测试体积含维生素B12的活度相当于约0.014ng/ml。
L 测定
