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脂肪中的丁酸
油和脂肪
- 柱色谱法
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A 仪器
A.1 色谱管
将截面外径为38cm长15cm的玻璃管熔拉成长20cm外径为22cm的细管，然后再熔拉成5cm长外径为7mm的带滴头的管子。
B 试剂
B.a 硅酸
在浅盘中或蒸发皿上175℃加热18h。在干燥器或密闭的容器中保存。
B.b 溴甲酚绿-甘醇溶液
在蒸气浴上加热使700mg的溴甲酚绿溶解于700ml的甘醇中。冷却后加入约200ml水。将约6.6ml NH4OH稀释到1L的水中以制备0.1N的NH4OH。加入40ml的此溶液到指示剂溶液中，再补加水至1L。将此蓝色溶液贮存在具塞瓶中。
B.c 填料
将H2SiO3，(a)，与溴甲酚绿-甘醇溶液，(b)，按100g比约95ml混合，直到获得一均一的橄榄绿状粉末。小批量可在研钵中混合，大批量时可用机械搅拌器混合。所制备的填料在密闭的容器中可保存数月。
B.d 已烷-丁醇混合物
将1体积的正丁醇加到100体积的正丁烷中〔市售级〕。
B.e 异丙醇-KOH溶液
将25gKOH颗粒在蒸气浴上加热和回荡的情况下溶解于400ml的异丙醇中。将上层醇溶液倒出，以使其与附于瓶底的少量水溶液分离。冷却后再倾出上层的异丙醇-KOH溶液，其中KOH的含量约为50mg/ml。此溶液应在冰箱中保存。
B.f KOH溶液
约0.05N。将60ml的异丙醇-KOH溶液，(e)，用440ml异丙醇和500ml的甲醇稀释。在棕色瓶或永红派热克斯玻璃瓶中保存。
B.g 百里酚蓝溶液
将300mg百里酚蓝溶解于25ml 0.05N KOH的醇溶液，(f)，中，加入75ml异丙醇。
C 脂肪酸溶液的制备
C.a 皂化
移取0.5－0.7g充分混匀的熔化脂肪到20×150mm的带嘴试管中，加入5ml异丙醇-KOH溶液，(e)，和沸石。将试管浸入沸水浴中5cm深处加热20min对脂肪进行皂化反应，蒸发掉异丙醇，留下固体皂。盖上盖在48h内进行分析。
C.b 水解皂所需酸的定量测定
在小烧瓶或烧瓶中将5ml异丙醇-KOH溶液，(e)，加入10ml水中，加2滴百里酚蓝溶液，(g)。在不断搅拌下，逐滴加入H2SO4(2+1)，直到起始的蓝色变为黄色，橙色，最后变为红色。用同一滴定管测量所需H2SO4的体积，即为随后水解皂所用体积。〔如果色谱柱的顶端在加入脂肪酸溶液时变为蓝色，说明要用再多一些量的H2SO4水解皂；色谱柱的顶端应为黄色。〕
C.c 皂的水解和脂肪酸的萃取
在冷水中冷却装有皂的试管，滴加按(b)所示的几滴H2SO4(2+1)。用玻璃棒搅碎试管底部的块状物。待试管中的物质完全混匀后，将获得粘附于K2SO4水相粘层的黄色脂肪酸混合物。向试管中加入10ml已烷－丁醇溶液；用玻璃棒充分搅匀。水相应粘附于K2SO4白色沉淀上，从而很容易将脂肪酸的溶剂溶液倾析出。此溶液待上色谱柱。
D 色谱柱的准备
在研钵中加35g填料的已烷-丁醇溶液。用搅棒搅拌使其形成泥浆状。将小块玻璃棉很蓬松地塞到色谱柱收口的一端，用玻棒小心地将其压到底部。用手指堵住柱子的收口端，加入已烷-丁醇溶液至储液池半满。用勺子将所制备的泥浆状物置于溶剂下部。使勺子沿柱池壁上下活动。$$当所有的填料加完后，取开手指使溶剂流出而填料下沉。在柱子的顶端施加5－10lb(34.5－68.9kPa)的空气压以加快溶剂的流速和使泥浆状物填充均匀。要最后一部分溶剂则渗入柱中时解除压力。如果柱子看上去填充的很均匀，便可使用，否则，再加入一些已烷-丁醇溶液按上述方法重新加压。所制备柱子在常压下的流速应为3.5ml/min左右。如果流速小于3ml/min，在填料中应再多加一些溴甲酚绿-甘醇溶液，重新混合。如果流速大于4ml/min，应在填料中再多加一些H2SiO3重新混合。制备柱子时所回收的已烷-丁醇溶液可供随后制备其它色谱柱或色谱分析中使用。
E 脂肪酸的色谱分析
将脂肪酸的溶液倾倒在所装柱的顶部，同时立即用250ml的锥形瓶收集洗脱液。当脂肪酸溶液完全进入填料后，用15ml已烷－丁酸溶液分3次洗涤柱子内壁，每次洗涤需等上次洗涤液完全进入填料之后，再添加。在柱子的顶端应观察到一黄色条带；此条带含有无机酸〔H2SO4和酸式硫酸盐〕且停留不动。$$如果样品中含有乳脂，将会观察到由丁酸所引起的第二条清楚的黄色条带，且此带很缓慢地向下移动而与顶端的条带脱离。长链脂肪酸，大于等于C6，将很快通过柱子而不产生黄色条带。从长链脂肪酸完全洗脱到丁酸开始出现之间的洗脱体积约20－30ml。当黄色丁酸区带的下沿离色谱柱底部1cm时，更换收集器。所收集的第一部分含有长链脂肪酸，通常为100±10ml。其次的120ml洗脱液中含有丁酸。
F 所收集脂肪酸的滴定
向每10ml要滴定的洗脱液中加1滴百里酚蓝溶液。用0.05N的KOH，(f)，以50ml的滴定管对第一部分收集液进行滴定，使第一个蓝色终点出现且不消失，用最小刻度为0.01ml的5ml滴定管对第二部分收集液进行同样的滴定。每个滴定终点都将非常敏锐，但由于吸取CO2而很容易褪色。如果滴定进行的很快且是缓慢摇动时，CO2的影响可忽略。如果需要时可在无CO2的气氛中进行滴定，它将使滴定结果具有很好的重复性。〔使空气流通过20%的KOH溶液，再通过水，最后到滴定瓶〕。$$无需进行空白校正。加入百里酚蓝的碱可抵消空白。$$用占两次滴定总和的百分数(%)表示丁酸的滴定结果，计算结果精确到0.1%。如：长链酸滴定＝26.1ml；丁酸滴定＝2.83ml；总和＝28.93。丁酸的摩尔百分数(%)＝2.83×100/28.9＝9.8。
