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油和脂肪中的脂肪酸甲基酯
油和脂肪
- 气相色谱法
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A 原理
动物和植物脂肪中含有8－24C原子的脂肪酸甲基酯，可通过气相色谱法加以分离和测定。此方法不适应于环氧、氧化或多聚脂肪酸。
B 仪器
以下是用于火焰离子化检测器的条件：
B.a 气相色谱
具有最小死体积的进样系统，其温度维持在比柱温高20－25℃。使柱温保持至少为220±1℃。如果采用程序化加热，建议用两根柱子。
B.b 色谱柱
1－3m×2－4mm〔内径〕玻璃或不锈钢〔当多不饱和组份具有3个以上双键时，不能用不锈钢柱〕柱。当有长链〔在于20C原子〕酸存在时，使用短柱子。
B.c 填料
经酸洗和硅烷化的硅藻土，粒度在125－250μm之间且具有窄的〔25μm〕变化范围〔No.60－120〕。平均粒度与内径成反比，与柱长成正比。涂渍有5－20%的聚酯型极性液体固定相〔二甘醇聚丁二酸，丁二醇聚丁二酸，甘醇聚已二酸等〕或其它可满足分离效率和分离度的固定相〔如氰基硅酮〕。在有些分离中也可使用非极性固定相。$$在与检测器分离的情况下，于185℃下使惰性气体以20～60ml/min流经柱子16h以上，再于195℃下2h，老化柱子。上述温度可随不同的液体固定相而改变。
B.d 进样器
最大体积10μl，最小刻度0.1μl。
B.e 记录仪
0－2.5或5mV量程，响应速度〔瞬间给100%信号时，记录笔从0到90%所用的时间〕小于1.5s，纸的最小宽度为25cm，走纸速度25－100cm/h，具有可供选择的衰减开关。如果需要积分时，应具有足够灵敏度的线性响应及良好的基线校正。$$如果使用热导检测器，应将条件改为：柱，2－4m×4mm内径；载体，粒度150－250μm〔No.60－100〕；固定相，15－25%；载气、He或H；无辅助气体；温度〔℃〕，柱温180－200，进样器温度应高于柱温40－60℃；载气流速，60－80ml/min；记录仪，0－1mV量程；进样体积，0.5－2μl。必须使用校正系数。
C 试剂
C.a 载气
干燥的N，He，Ar，其氧的含量<10mg/kg。
C.b 其它气体
H，99.9%以上，无有机杂质。空气或氧化应无有机杂质存在〔相当于CH4的碳氢化合物<2ppm)。
C.c 参比标准
已知的甲酯混合物或已知组分的油甲酯混合物，其组成最好与被分析样品的接近。
D 操作条件
下面是在选择适当测试条件的一些可变量：柱子的长度及内径，柱子温度，载气流速，所需分辨率，样品体积及分析时间。进样体积应使检测器和静电所具有线性响应。一般来说，下述条件可使硬脂酸甲酯在理论塔板数大于等于2000时，在约15min内被洗脱下来。$$柱内径，mm@载气流速，ml/min@固定相浓度，%@柱温，℃$$2@15－25@5@175$$3@20－40@10@180$$4@40－60@15@185$$ @ @20@185$T如果仪器允许时，进样器应保持在约200℃，检测器的温度应高于柱温。流入检测器的氢应为载气的一半左右〔在载气为N气，柱内径为2mm时，H可与载气具有相同流速〕；O的流速应为H的5－10倍。
E 性能指标
以约相同比例的硬酯酸甲酯和油酸甲酯〔如可可酯中的甲基酯〕混合物进行分析调试。调节进样体积，柱温和载气流速使硬脂酸甲酯的峰在溶剂峰后约15min出现，并约为满量程的3/4。以mm为单位，分别测量硬脂酸甲酯和油酸甲酯色谱峰曲线拐点的切线与基线交点的距离，以其作为峰底宽w1和w2。同时以mm为单位，测量从起始到硬脂酸甲酸的峰最大值的距离作为其保留距离(S)，以及硬脂酸甲酯的峰最大值到油酸甲酯峰最大值的距离Y〔单位，mm〕。计算理论塔板数n〔效率〕和分离度R：$$n＝16(S/w1)^2^$$R＝2Y/(w1+w2)$$选择条件使n大于等于2000和R大于等于1.25。此外，亚油酸(18：3)甲酯应与花生四烯酸〔20：0〕和顺式9-二十碳烯酸〔20：1〕酯分开。柱子在使用过程中R值将下降；当其值小于等于1.25时应更换柱子。
F 测定
在仪器具有稳定的基线时，注射0.1－2μl，5－10%甲酯的庚烷溶液，27-21A。如果所分析份量很少，进样量可增加小于等于10倍。穿透进口部分的胶垫，很快将样品注入。抽出进样针，由于空气或溶剂将在记录纸上出现一小峰，记下开始的参比点。调节进样体积使主要的峰衰减小于8倍，最好再小一些。需要时可改变衰减器档次，以保证峰在记录纸上。在记录纸上记下衰减器所处位置。$$对于测量小于C12的酸，需采用较低的柱温，测定大于C20的酸时需采用较高柱温。在这种情况下采用程序化升温是很有用的，如对于小于C12的酸，在100℃时进样，然后以4－8℃/min使温度升到最佳值，或使温度程序化升到某一固定温度，然后恒定在此温度直到所有组份都流出来。如果仪器没有使用程序化加热，在100℃和195℃之间的两个固定温度下进行操作。
G 组分的确定
在与样品测试相同的条件下分析参比标准混合物。测量所有已知酯的保留距离〔S〕。以logS对酸的C原子数作图。在等温条件下，具有相同不饱和度直链酯的曲线应为直线，且近似平行。从这些曲线中确定样品峰，必要时可进行内推。避免出现“掩蔽峰”，即峰不能完全分开的分离条件。$$酯按C原子数的增加和具有相同C原子数时按不饱和度的增加而依次出峰。C16在C18之前，C18甲酯按下列顺序出现：硬酯酸〔18：0〕，亚油酸〔18：2〕和亚麻酸〔18：3〕。C20饱和酯〔花生酸酯，20：0〕通常在18：3酯之前出峰，但在某些柱子中可能相反，或随所用柱子的不同而峰位置有所改变。
H 计算
采用归一化法，假定样品中所有组份都在色谱图中出现，因此峰面积的总和代表100%组分〔总洗脱〕。$$如果仪器带有积分器，可采用所示的数值。如果仪器不带积分器，采用成三角形法：画出两个峰两边的切线使其与基线相交。以所得三角形的高〔衰减改变要进行校正〕乘以1/2基线宽计算三角形的面积。对于进行自动衰减的峰，峰宽可通过从峰的外边画切线〔这些峰达到记录纸的整个宽度，且峰的2/3以上被利用〕使其与基线相交而获得。用峰高〔经衰减校正〕乘以1/2基线计算面积。$$如果<12C原子的组份含量甚微，计算每个组份的重量百分含量(%)，以甲基酯表示。$$Ci＝Gi×100/∑Gi$$式中Gi为i组份所对应的面积，∑Gi为所有峰的面积之和。$$在有些情况下，如有<12C原子组份存在，组份分子量相差很大以及存在有二级官能团时，需要用校正因子将峰面积转换为重量百分含量(%)。在与样品操作条件完全相同的条件下分析组成相似的已知参比标准的甲酯组份可测量出校正因子。对于参比标准，$$i组份的重量%＝Bi×100/∑Bi$$式中Bi为参比标准中i组份的重量，∑Bi为参比标准中所有组份的重量之和。从色谱图计算：$$i组份%〔面积/面积〕＝Gi×100/∑Gi$$从中计算出每一组份的校正因子$$Ki＝(Bi/∑Bi)×(∑Gi/Gi)$$测定相对于软脂酸的校正因子，K16＝1，因此，$$K'＝Ki/K16$$然后计算每一组份〔以甲基酯表示〕的%，用适当的校正因子乘以其面积，再求出校正面积的总和：$$i组份重量%＝(K'i×Gi)×100/∑(K'i×Gi)$$在有些情况下，如当不是所有的组份都被洗脱时，采用内标，S，如C15或C17甲酯，测定其校正因子，此时，$$以甲基酯表示的i组份的重量%＝$$(w^^s^^/w)×(K'i/K's)×(Gi/Gs)×100$$式中w^^s^^为内标的毫克数，w为样品毫克数，下标S代表内标组份。$$用下述有效数字位数报告到小数点后1位数：3对应于大于等于10%，2对应于1－10%，1对应于<10%。
I 精密度
I.a 重复性
对于同一样品的主要组份〔大于5%)同一操作者在同一天于相同仪器上所做两次独立测定结果相差相对值应不大于3%，绝对值1%。
I.b 再现性
不同实验室对主要组份进行的两次独立测定结果相差相对值应不大于10%，绝对值的3%。
