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油和脂肪中的芥酸
油和脂肪
- 薄层和气相色谱法
- [适应于动物及植物的油和脂肪，包括含有鲸蜡烯酸〕鱼油中的顺式-11-二十二烯酸〕以及可能同时含有顺式-和反式-二十二烯酸异构体的氢化油酯]
A 原理
脂肪酸组份可被转化为甲基酯，通过低温银化薄层色谱法加以分离。用气相色谱进行定量。
B 仪器
B.a 玻璃仪器
50ml烧杯，100和500ml圆底烧瓶，小的尖底玻璃试管。
B.b 蒸馏设备
用于蒸馏乙醚，配有通N气装置。
B.c 色谱柱
玻璃柱，约200×10mm内径，配有玻璃棉或多孔玻璃滤器〔或用小的带有多孔玻璃滤器的漏斗〕装有硅胶填料。
B.d 烘箱
温度调至100±2℃。
B.e 薄层色谱〔TLC〕板
20×20cm，玻璃，铺有硅胶G或类似产品。
B.f TLC点样器
将样品溶液沉积为一窄带或条。
B.g TLC展开缸
带有盖。
B.h TLC深度冷冻设备
能够盛放展开缸，里面温度为－20℃到－25℃。
B.i UV灯。
B.j 气相色谱仪
配有火焰离子化检测器〔27-22B或类似系统〕。最好配有电子积分仪。
C 试剂
所有试剂均为分析纯试剂。
C.a 正已烷。
C.b 甲苯。
C.c 甲醇
50%水溶液(v/v)。
C.d 乙醚
新蒸馏，不含过氧化物及残杂。
C.e TLC展开剂
甲苯-正已烷(90+10，v/v)。
C.f 芥酸甲酯标准溶液
5mg/ml。将50mg芥酸甲酯溶于3－4ml已烷中，用已烷稀释到10ml。
C.g 硝酸银溶液
200g/L。将24gAgNO3溶于水中，用水稀释至120ml。
C.h 二十四〔烷〕酸甲酯内标溶液
0.25mg/ml。将25mg二十四〔烷〕酸甲酯溶于3－4ml已烷中，用已烷稀释到100ml。
C.i TLC喷显剂
0.5g2'，7'-二氯荧光素/L。在加热和搅拌下将50mg2'，7'-二氯荧光素溶于100ml 50%甲醇水溶液中。
D 脂肪酸甲酯的制备
E 薄层色谱
E.1 TLC板的制备
于500ml圆底烧瓶中加入60g硅胶粉和120mlAgNO3溶液，(g)，振荡1min可获得供5块板使用的完全均匀的浆状物。按常规方法铺板使板上薄层的厚度约为0.5mm。等板在空气中部分干燥后〔最好在暗处放置约30min〕在100±2℃的烘箱中使其完全干燥并活化2.5h。板活化后应尽快使用。〔如果板不变黑，在110℃活化1h也可满足要求。〕使用前，在距每个板两边和顶端各10mm处涂布层上涂划刻痕线以减小展开中的边缘效应。
E.2 甲酯的点样
在距板的左边边沿至少40mm，距底边至少10mm处利用点样器，使50μl甲酯溶液〔D〕沉积于一长约50mm的窄条纹中。同样将100μl含有相同体积的甲酯溶液和芥酸甲酯标准液，(f)，点在板的右边。点样时应小心，因为涂层很脆而易碎。在上述两个点带的中间点上50μl芥酸甲酯标准溶液以帮助确认展开后的芥酸甲酯带。将板的底边置于乙醚(d)中，直到乙醚上升到点样面区上方约5mm处，将甲酯浓缩到窄带中。
E.3 板的展开
将TLC展开剂，(e)，倒入展开缸中约5mm深。将缸和盖置于深度冷冻设备中至－22℃，或尽可能接近此温度。〔在有些情况下，给缸中衬些滤纸使其与展开剂相接触将更有利〕。2h后，小心地将薄层板放入展开缸中使溶剂上升到约1/2到2/3板高。取出薄层板，在通风橱中蒸发溶剂，用N气流使板上的残余溶剂挥发。将薄层板重新放入缸中使溶剂上升到板的顶部。取出薄板，按上述方法，N气流吹干。用喷显剂(i)，喷板。在UV光下看板。通过比较样品中加有芥酸甲酯时所获得加强的带和芥酸甲酯单独时〔中间样品〕的条带，对样品中所含芥酸甲酯带进行定位。
E.4 甲基酯组分的分离
非常小心地将样品中含有芥酸甲酯的条带刮下，以避免损失〔第1部分〕。同样将薄板上样品中在芥酸甲酯以上和以下的含有其余脂肪酸的条带刮下〔第2部分〕，分别放在烧杯中。向每一烧杯中加入1ml二十四〔烷〕酸甲酯内标溶液，(h)，和10ml乙醚。搅拌后，将其转移到分离柱或漏斗中(c)，每个约含1g硅胶。用乙醚萃取3或4次，每次用乙醚10ml，用100ml圆底烧瓶收集滤液。用温和的N气流使每个滤液挥发至很小体积。将溶液转移到尖底玻璃试管中，用N气流挥发掉所有的溶剂使其浓缩于试管的底部。用20－50ml已烷解甲酯。
F 气相色谱
G 计算
以所制备样品中总脂肪酸甲酯含量的%计算样品中芥酸的含量，以甲酯表示：$$%芥酸＝E/{I1×[(M1/I1)+(M2/I2)]×100}$$式中E为第1部分芥酸甲酯的峰面积；I1和I2分别为第1部分和第2部分内标的峰面积；M1和M2分别为第1和第2部分不包括内标峰的总甲酯峰面积。$$如果峰面积测定按%，则M1和M2可按下式计算：$$M1＝100－I1$$M2＝100－I2$$上述计算假设样品中二十四〔碳〕酸的含量可以忽略不计。如果样品中存在有大量的二十四〔碳〕酸〔峰面积＝I'2〕，按下式计算I2：$$I2＝I'2－I3$$式中I3＝〔T×P〕/Pt$$而I3代表I'2的一部分这部分是从样品中衍生来的二十四〔碳〕酸甲酯峰面积；P为色谱图中第2部分脂酸甲酯酸峰面积；T和Pt分别为按上述样品酯化，没有进行TLC分离和未加二十四〔碳〕酸甲酯内标溶液时，气相色谱所得总的脂肪酸甲酯的色谱图中二十四〔碳〕酸甲酯和软脂酸甲酯的峰面积。
H 精密度
H.a 重复性
同一操作者在相同条件下对芥酸含量大于5%时，同时或很快连续测定同一样品的两次测定结果不应超过1.5g/100g样品或测定值的3%，无论那一个值都不允许更大。对于芥酸含量小于5%时，精密度可降低一些。
H.b 重现性
对于同一测试样品，其芥酸含量大于5%时，两实验室所测定结果不应超2.2g/100g样品或测定值的5%，无论哪一个都不允许更大。对于芥酸含量小于5%时，准确度可降低一些。
