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    奶油油中的β-谷甾醇

    油和脂肪

    气相色谱法
        〔适用于样品中含有大于等于4mg游离β-谷甾醇/100g奶油油〕
    A 原理
        游离的3-β-OH甾醇可通过与毛地黄皂苷相络合而从奶油中除去,然后甾醇可通过用二甲基亚砜〔DMSO〕作为洗脱液从毛地黄皂苷化合物-硅藻土柱而除去〔注意:DMSO有害。应戴上橡胶手套以避免与皮肤接触。请使用有效的排雾设备〕。100g奶油油中大致有0-1mgβ-谷甾醇,冰淇淋大致是约4mg/100g乳化剂脂肪。
    B 试剂
        
    B.a 硅藻土
        Celite545。
    B.b β-谷甾醇标准溶液
        2μgβ-谷甾醇/μl CHCl3,用标准品〔95%β-谷甾醇,5%菜油甾醇〕制备。
    B.c 正已烷
        用KOH蒸馏纯的正已烷。
    C 仪器
        
    C.a 气相色谱
        操作条件,温度〔℃〕:柱温225-245,进样部分和火焰离子化检测器温度265-285。调节N2载气流速〔约50-60ml/min〕以获得如下保留时间(min);胆甾醇16-18,菜油甾醇22-24,以及β-谷甾醇28-30。采用装有含有3%JXR聚硅氧烷的100-200目Gas-Chrom Q的色谱柱。在103.4-138kPa氮气和250℃下使柱子老化24h。
    C.b 性能
        通过观察分离菜油甾醇和谷甾醇的峰分离度=2D/(C+B)以检测柱子的气相色谱〔分离〕性能。上式中D为两个峰最大值之间的距离,C为菜油甾醇的基线宽度,B为β-谷甾醇峰的基线宽度。峰分离度应大于等于1.6。
    C.c 注射技术
        用10μl的哈密顿微量注射器,向腔内吸入1μl空气。将针插入溶液中,向腔内吸入所需量的溶液。从溶液中取出针头并吸入1μl空气到腔内。如果需要时,注意体积范围及调节到所需体积。
    C.d 标准曲线的制作
        制备2μgβ-谷甾醇/μl CHCl3标准溶液〔按27-30B(e)测定标准的组成〕用3个以上点当作1-10μgβ-谷甾醇范围内的标准曲线。以β-谷甾醇的峰面积对μgβ-谷甾醇作图。
    D 色谱柱的制备
        在加热的情况下,将300mg毛地黄皂苷溶于5ml水中,将其加到含有10g硅藻土的研钵中研磨,充分混匀。〔填料在密封的容器中5℃下可存放几个月〕。将3g硅藻土-毛地黄皂苷混合物转移到2×12cm的管中,该管流出口的内径约5mm,在管子底部装有小块玻璃棉,并用一短节橡胶管和弹簧夹封口。用夯击棒使填料填充紧密。〔紧密填装的柱子流速为0.5-0.75ml/min〕。用5ml正已烷饱和柱子,让其流经填料直到正已烷液面到达填料顶端。立即使用柱子。不要让其流干。
    E 样品的制备
        将900mg的奶油油溶于3ml正已烷中。用一次性移液管将其定量转移到毛地黄皂苷-硅藻土柱中,使其流入柱中到所有溶液全进入填料。用正已烷洗涤样品烧杯2次,每次用2ml,并将其加入柱中,加时冲洗管壁。用正已烷洗柱5次,每次用2ml。待所有的正已烷流进柱后,用苯洗5次,每次用2ml,待最后一次苯到达离填料上界面约1cm时,取掉橡胶管,用苯充分洗涤柱子下端的内外表面以除去痕量的脂肪〔如果没用溶剂洗涤柱壁和柱顶端,则由于甘油三酯的干扰而导致差的色谱分离图〕。弃去正已烷和苯。待苯液面即将进入填料下界面时开始用10ml的DMSO进行洗脱。用15ml带螺丝帽的离心管收集DMSO流出液。$$向流出液中加入3ml正已烷,振荡后,离心。将含有甾醇的上层液转移到第二个带有螺丝帽的离心管中。用4ml正已烷-苯(1+1)再萃取第一个离心管中的DMSO液层两次,每次将上层液小心地转移到第二个离心管中。加入3ml水,剧烈振荡后,离心直至澄清。移取上层液在氮气氛或滤过的空气中,于30ml烧杯中,在蒸气浴上加热蒸发之。用CHCl3分二次将残余物转入0.5英钱的具螺丝帽小瓶中,每次用CHCl3 0.8ml。待在氮气或滤过空气下于蒸气浴上蒸干溶剂后,将残余甾醇溶于0.1ml CHCl3中,用于GC分析。
    F 测定
        注射2-8μl萃取样品,将峰面积转换为重量,计算β-谷甾醇的含量,标准曲线需当天绘制。$$mgβ-谷甾醇/100g奶油油=$$〔曲线查到的μg/1000〕×(100/注射μl)×(100/g样品〕$$通过与已知化合物的保留时间相比,以确定奶油油样品中的峰。相对保留时间如下:胆甾醇1.0,菜油甾醇1.4,β-谷甾醇1.7。
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