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    动物饲料中的氮〔硝酸盐和亚硝酸盐〕

    动物饲料

    比色法
        
    A 原理
        硝酸盐和亚硝酸盐用氯化镉和氯化钡溶液来提取,大部分可溶性蛋白质在碱性溶液中沉淀出来。使澄清的溶液通过金属镉柱,将硝酸根还原为亚硝酸根,然后用比色法测量亚硝酸根〔注意:镉盐是有毒的〕。
    B 试剂和仪器
        
    B.a 硝酸盐氮标准溶液
        
    B.a.1 贮备液
        12μg硝酸盐氮/ml。溶解0.867g KNO3于1L的水中,用水稀释25ml此溶液至250ml。
    B.a.2 工作液
        用水稀释5,10,15,20和25ml贮备液到100ml,制得0.6,1.2,1.8,2.4,3.0μg氮/ml的工作液。
    B.b 提取液
        溶解50g CdCl2和50g BaCl2并用水稀释至1L。用HCl调节pH为1。
    B.c 氯化铵缓冲溶液
        pH9.6。溶解50g NH4Cl于500ml水中,用NH3调节溶液的pH,用水稀释至1L。
    B.d 氢氧化钠溶液
        2.5N。将50g NaOH溶于500ml水中。
    B.e 磺胺溶液
        0.5%。溶解1.25g磺胺于250ml HCl(1+1)中,溶液稳定1-2个月。
    B.f 偶联剂
        将0.5g N(1-萘基)乙二胺的盐酸盐溶于100ml水中,贮于带玻璃塞的深色瓶中放入冰箱中保存。溶液稳定几个星期。
    B.g 盐溶液
        溶解100g NaCl于500ml水中,加入50ml缓冲溶液(c),用水稀释至1L。
    B.h 还原管
        带有活塞和贮槽的25ml滴定管或相似内径的层析管。
    C 层析柱的制备
        将锌棒插进500ml 20%CdSO4溶液制取金属Cd。反应3h后,弃去溶液,刮下在锌棒上长成的海绵状的镉。将Cd放在高速混合器中,加入500ml水,搅拌2min。用水将细金属粒洗入筛中。收集20-40目的颗粒。将水灌进还原管,加入2cm下玻璃毛塞,用玻璃棒将毛塞推到柱底并用玻璃棒压塞子使玻璃毛中吸附的空气全部排出。在很轻的敲打下加入Cd粒到约10cm深,用25ml 0.10N HCl的洗一次,25ml水洗2次,再以25ml稀释了的(1+9)缓冲溶液(c)洗一次。柱不用时应用盐溶液(g)浸没。$$一般情况下,如果在两次分析之间将柱子保持在盐溶液里面,柱子就可以重复使用。当连续处理蛋白质和其它有机物含量高的样品时,流速可能会逐渐减慢。用25ml 0.1N HCl处理可以恢复原来的流速;如果仍不能恢复,则应制备新柱。流速的重现性是很重要的。实际上流速可以是3-5ml/min,但是一旦确定以后,在进行样品和标准测量时,流速必须必须保持不变(±0.1ml)。
    D 标准曲线的制备
        制备3,6,9,12和15μg硝酸盐-亚硝酸盐氮的工作曲线,分别吸取5.00ml一份的工作溶液,放入30ml烧杯中,加入5ml缓冲溶液(c)和15ml水,混匀。用少量水定量转入还原柱,调节过柱流速在3-5ml/min,当贮槽刚刚放空时,加入15ml盐溶液(g)。收集淋洗液,包括盐洗液放入50ml容量瓶中〔总的淋洗液体积应该约为40ml〕。加入5ml磺胺溶液(e),混匀,放置3min。加入2ml偶联剂(f),混和一下,用水稀释至刻度,混匀。放置20min以达到显色完全,颜色稳定2h以上。以试剂空白为参比用1cm比色皿在540nm测定吸光度A,以A对硝酸盐-亚硝酸盐氮的微克作图。
    E 提取
        
    E.a 低含量硝酸盐样品〔谷粒类,面粉类,添加剂类等〕
        将5g细磨过的样品洗进250ml容量瓶,加入100ml提取液(b),100ml水,混和在一起。放置1h,时而转动一下。加入20ml 2.5N NaOH,用水稀释至刻度,混和后,立即用快速滤纸过滤。移取10ml缓冲溶液(c)放入100ml容量瓶中,用清晰的滤液稀释至刻度,混匀。
    E.b 干燥的高含量硝酸盐的产品〔干的植物类,干草类,面粉类等〕
        称取5.0g细磨过的样品放入500ml容量瓶,加入100ml提取液(b),300ml水混和在一起,放置1h,时而转动一下。加入40ml 2.5N NaOH,用水稀释至刻度,摇匀,立刻用快速滤纸过滤。移取10ml缓冲溶液(c)到100ml容量瓶里,用清晰的滤纸稀释至刻度,混匀。
    E.c 草类、青储饲料和其他多汁物质
        称取100g样品放入1加仑容积的高速混和器中,加入100ml提取液(b),800ml水,包括样品自身所含的水量。搅拌1min,倒进2L烧杯中,放置1h。加入100ml缓冲溶液(c)〔总体积为1L〕,混匀,通过Whatman 42号滤纸过滤,收集澄清的滤液供使用。
    F 测定
        
    F.a 硝酸盐和亚硝酸盐氮总量
        制备3,6,9,12和15μg硝酸盐-亚硝酸盐氮的工作曲线,分别吸取5.00ml一份的工作溶液,放入30ml烧杯中,加入5ml缓冲溶液(c)和15ml水,混匀。用少量水定量转入还原柱,调节过柱流速在3-5ml/min,当贮槽刚刚放空时,加入15ml盐溶液(g)。收集淋洗液,包括盐洗液放入50ml容量瓶中〔总的淋洗液体积应该约为40ml〕。加入5ml磺胺溶液(e),混匀,放置3min。加入2ml偶联剂(f),混和一下,用水稀释至刻度,混匀。放置20min以达到显色完全,颜色稳定2h以上。以试剂空白为参比用1cm比色皿在540nm测定吸光度A,以A对硝酸盐-亚硝酸盐氮的微克作图。
    F.b 亚硝酸盐氮
        称取一份清晰的试样滤液〔所含亚硝酸盐的量小于15μg〕,放入50ml容量瓶,用水稀释至约40ml,充分混和,加入5ml磺胺溶液(e),混合一下,放置3min,加入2ml偶联剂(f),用水稀释至刻度。充分混合,放置20min使显色完全。用1cm比色皿在540nm以相同稀释度的样品提取液为参比测量吸光度。校正亚硝酸根试剂空白。
    F.c 硝酸盐氮
        由上述的(a)与(b)之差算得。
    G 计算
        亚硝酸盐氮和〔或〕硝酸盐氮的ppm数=测得的硝酸盐氮的微克数×稀释因子/g样品提取液的稀释因子(a)为11.1,(b)为22.2,(c)为200。
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