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动物组织中的3，5-二硝基邻甲苯酰胺〔ANOT〕残留物
动物组织中的药物和饲料添加剂
- 分光光度法
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A 原理
ANOT的代谢物，是用无花果蛋白酶从磨碎的组织中消化酶面释放的。用NaHCO3处理消化物并用丙酮萃取。加CHCl3使溶液分为2层。浓缩有机层并通过氧化铝柱。用CHCl3洗涤被吸附的ANOT并用80%的乙醇淋洗。使乙醇溶液通过阳离子交换树脂，用4N HCl洗提ANOT。在540nm测定重氮化并与N-1-萘乙二胺偶联所形成的有色化合物。
B 仪器
B 氧化铝柱的制备
将玻璃毛小塞插入色谱管并压到底部。装60g氧化铝，在橡胶塞上轻敲管子压实，至约30cm高。加100ml CHCl3并放到刚好在氧化铝层上方。不要让CHCl3流到氧化铝层面以下。
B.a 色谱管
600×16mm内径。
B.b 离子交换树脂柱
180×11mm内径。
B.c 混合器
具有防爆裂马达的高速、高剪切混合器，约1L容量。
B.d 分光光度计。
C 试剂
C 离子交换柱的制备
用400ml 6N HCl，在蒸气浴上加热100g Dowex 50W-X8 2－3h。在瓷漏斗上过滤，用H2O洗到洗液不含酸。用100ml 80%乙醇洗树脂，然后用250ml 80%乙醇与树脂混合。将足量的树脂浆灌入离子交换柱直到沉降后床高约5cm。用25ml 80%乙醇洗树脂。可略增气压提高液体通过树脂的流速。不要让液面流到树脂顶层以下。
C.a 氧化铝
活性的，Alcoa牌F－20级，80－200目。
C.b 3-氨基-5-硝基-邻-甲苯甲酰胺
ANOT，分析标样。
C.c 硫酸铵溶液
1.0%，每周新配。
C.d 偶联试剂
0.25%的N-1-萘乙胺·2HCl水溶液。每周新配并存放在棕色瓶中。
C.e Dowex50W-X8阳离子交换树脂
氢型，200－400目。
C.f 无花果蛋白酶
ICN药品有限公司。$$〔注意：无花果蛋白酶是进攻活组织的强力蛋白水解酶。应避免接触皮肤和眼睛，并防止吸入其粉尘。〕
C.g 亚硝酸钠溶液
0.25%。每天新配。
D 标准曲线的制备
采集组织，用固体CO2冰冻，在分析前一直保存在冰箱中。在组织至少部分冻结时研磨，并称50g放入1L Mason瓶。加125ml H2O，15ml 1N HCl和5g无花果蛋白酶，用混合器混合约5min，盖紧瓶子并在30℃保持24h，然后在70－80℃水浴中保持30min，取出并冷却。$$称约10g NaHCO3，在搅拌下慢慢加入瓶中，小心不要使样品溢出瓶颈。泡沫消失后，加500ml丙酮，用混合器混合5min。$$用瓷漏斗，通过11cm滤纸和约5g Super-Cel滤垫过滤到1L滤瓶中。用200ml丙酮洗残渣，把洗液收集在同一瓶中。把滤液转入2L分离器，加1L CHCl3，用力摇动分离器中的萃取物，放置到分层。将CHCl3层沥入2L烧杯。用200ml CHCl3萃取水层，将CHCl3洗液与原来的萃取液合并。于加热灯下通气流蒸发CHCl3到约50ml。加100ml CHCl3，再蒸发到50ml。如果溶液不清，再加入并蒸发CHCl3以除去H2O。$$将清CHCl3溶液加到氧化铝柱，并放到氧化铝平面。用4份50ml CHCl3洗。弃去洗液。加90ml 80%乙醇到柱中洗提ANOT。弃去前30ml流出液，把60ml收集在100ml烧杯中。把此溶液转到离子交换柱。轻微气压可增快溶液流动。溶液放到树脂层顶部后，用50ml 80%乙醇洗，接着用50ml H2O洗。弃去洗液。加45ml 4N HCl并收集流出液于50ml容量瓶。$$加1ml 0.25%NaNO2，混合，放置5min。加1ml 1%硫酸铵溶液，混合，放置5min。加1ml偶联试剂，混合，用4N HCl定容，并彻底混匀。放置15min，用1cm比色皿，以H2O为参比，在540nm读A。
G 测定
采集组织，用固体CO2冰冻，在分析前一直保存在冰箱中。在组织至少部分冻结时研磨，并称50g放入1L Mason瓶。加125ml H2O，15ml 1N HCl和5g无花果蛋白酶，用混合器混合约5min，盖紧瓶子并在30℃保持24h，然后在70－80℃水浴中保持30min，取出并冷却。$$称约10g NaHCO3，在搅拌下慢慢加入瓶中，小心不要使样品溢出瓶颈。泡沫消失后，加500ml丙酮，用混合器混合5min。$$用瓷漏斗，通过11cm滤纸和约5g Super-Cel滤垫过滤到1L滤瓶中。用200ml丙酮洗残渣，把洗液收集在同一瓶中。把滤液转入2L分离器，加1L CHCl3，用力摇动分离器中的萃取物，放置到分层。将CHCl3层沥入2L烧杯。用200ml CHCl3萃取水层，将CHCl3洗液与原来的萃取液合并。于加热灯下通气流蒸发CHCl3到约50ml。加100ml CHCl3，再蒸发到50ml。如果溶液不清，再加入并蒸发CHCl3以除去H2O。$$将清CHCl3溶液加到氧化铝柱，并放到氧化铝平面。用4份50ml CHCl3洗。弃去洗液。加90ml 80%乙醇到柱中洗提ANOT。弃去前30ml流出液，把60ml收集在100ml烧杯中。把此溶液转到离子交换柱。轻微气压可增快溶液流动。溶液放到树脂层顶部后，用50ml 80%乙醇洗，接着用50ml H2O洗。弃去洗液。加45ml 4N HCl并收集流出液于50ml容量瓶。$$加1ml 0.25%NaNO2，混合，放置5min。加1ml 1%硫酸铵溶液，混合，放置5min。加1ml偶联试剂，混合，用4N HCl定容，并彻底混匀。放置15min，用1cm比色皿，以H2O为参比，在540nm读A。
H 计算
从标准曲线得到与A相应的微克ANOT.ppm样品中ANOT＝微克ANOT/g样品
