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动物组织中的3，5-二氯-4-甲氧基-2，6-二甲基吡啶(Clopidol)残留物
动物组织中的药物和饲料添加剂
- 气相色谱法
- 重氮甲烷有毒，能引起特殊的过敏性，并且是一种潜在的爆炸物。制备重氮甲烷试剂，甲基化和蒸发应在通风橱中进行。避免使用金属、磨损的玻璃接口、腐蚀或划痕的玻璃器皿和锋利的边口。将重氮甲烷溶液存放在冰箱中，不要直接暴露在阳光或强人造光下。
A 原理
用MeOH提取组织和蛋；在氧化铝和阴离子交换柱上过滤提取物并清洗。流出液用重氮甲烷甲基化，成为Clopidol的甲醚产物，用电子捕获GC测定。在鸡组织中大于等于0.1ppm，蛋中大于等于0.05ppm时可适用。
B 仪器
B.a 离心机
临床用。带盖和能容纳13×100mm管的杯槽。
B.b 烧瓶
500ml，圆底＄平均29/42颈。用火焰喷烧加热约2cm直径的斑，并用圆头工具向内推压此斑做6个不等间隔的6mm凸起点。
B.c 气相色谱仪
带电子捕获检测器。操作条件：温度〔℃〕－柱温155，注射口220，检测器220；流速－N2载气120ml/min；灵敏度3×10^-10^A；记录纸速20"/h。
B.d 气相色谱柱
80－100目Chromosorb W〔AW〕上涂25%DC－200硅油。色谱柱，也可按下法制备：称12g用100号筛筛过的细Chromosorb W(AW)，放入含100ml CHCl3和3gDC－200液体的专门改进的圆底烧瓶(b)。在真空旋转蒸发器上干燥。用加热灯或热H2O帮助蒸发。过筛并弃去通过100号筛的细粉。填入1.9m×3mm内径U型硼硅酸盐玻璃柱，而且规定使用前，在200℃通75－100ml/min N2气流不少于18h。把填料加到柱上，在底部开孔以便填实。在流出端插入玻璃毛塞。注射支管中填充物平面应比入口处针头深度低几毫米。
B.e 液相色谱柱
B.e.1 氧化铝柱
将6g〔装满1个5ml烧杯〕氧化铝C(a)，加到带有粗烧结盘和30×5mm内径茎的300×18mm内径的柱中。
B.e.2 阴离子交换柱
用MeOH把1cm〔固定后〕AG1－X8树脂，C(b)，转入带有粗烧结盘和30×5mm茎的170×10mm柱中。利用来自洗耳球的空气压力，用2ml MeOH淋洗柱子。
B.f 均化器
B.g 绞肉机
带不锈钢配件。
B.h 振荡器
腕动式。
B.i 培养管
13×100mm，带13mm衬橡胶的塑料螺旋帽。
C 试剂
C.a 氧化铝
ALcoa F-20，80－200目。
C.b 阴离子交换树脂
Bio-Rad AG1-X8，100－200目，醋酸盐类。
C.c 重氮甲烷试剂
约18mg/ml乙醚溶液。在125ml长颈蒸馏瓶中装好10ml含6g KOH的H2O加35ml 2-〔2-乙氧基－乙氧基〕乙醇。将磁搅棒放入瓶，并把蒸馏瓶固定在搅拌器加热盘顶部水浴上方。把滴液漏斗与串联的250和50ml锥形瓶的高效冷凝器连接。在第二个瓶中放25ml醚，把入口管放在醚表面以下。在冰中冷却二个接收瓶。把140ml醚中溶有21.5gN-甲基-N-亚硝基-邻甲苯磺酰胺的溶液放入滴液漏斗。加热H2O浴到55℃，调整高度加热蒸馏瓶。加Diazald溶液时搅拌烧杯内容物20min。蒸馏物接近无色时，停止蒸馏。合并两个接收器的内容物。于0℃存放在螺旋帽的培养管中。若保存在冰箱中的全密封管中，试剂可稳定数周。
C.d 甲醇盐酸
5%。加25ml HCl到475ml MeOH中。
D 标准溶液
D.a Clopidol标准溶液
D.a.1 贮备液
100μg/ml。在称量瓶中准确称约100mg Clopidol分析标样，用MeOH转移入1L容量瓶，使总体积约为950ml。磁力搅拌到Clopidol溶解〔可能需2－3h〕。在室温定容并混匀。
D.a.2 中间溶液
10μg/ml。移取10ml贮备液放入100ml容量瓶，用MeOH定容，混匀。
D.a.3 工作液
1μg/ml。移取10ml中间溶液放入100ml容量瓶，用MeOH定容，混匀。
D.b 3，5-二氯-4-甲氧基-2，6-二甲基吡啶(Clopidol甲基醚〕标准溶液
D.b.1 贮备液
1mg(Clopidol)当量/ml。在称量瓶中称107.3mg3，5-二氯-4-甲氧基-2，6-二甲吡啶分析标样用苯转移入100ml容量瓶，用苯定容，混匀。
D.b.2 中间溶液Ⅰ
10μg Clopidol当量/ml。移1ml贮备液放入100ml容量瓶，用苯定容，混匀。
D.b.3 中间溶液Ⅱ
1.0μg Clopidol当量/ml。移10ml中间溶液Ⅰ放入100ml容量瓶，用苯定容，混匀。
D.b.4 工作溶液
用苯稀释中间溶液Ⅱ制备一系列含量为0.01到0.2μg Clopidol当量/ml的标准溶液。
E 标样色谱
用苯充满注射器针头，避免截留空气，抽入3μl Clopidol甲基醚工作溶液的等分样品，注射到柱上。测量峰高〔PH〕以满度偏转%表示，以PH对μg/ml作图。每日制作标准曲线，在每测1或2个样品后注射标准溶液进行校核。
F 测定
F.a 肌肉、肝和肾
用苯充满注射器针头，避免截留空气，抽入3μl Clopidol甲基醚工作溶液的等分样品，注射到柱上。测量峰高〔PH〕以满度偏转%表示，以PH对μg/ml作图。每日制作标准曲线，在每测1或2个样品后注射标准溶液进行校核。
F.b 蛋
用绞肉机研磨均匀。准确称约20g组织放入125ml广口瓶。加50ml MeOH和3g HyFlo Super-Cel肌肉助滤剂；对于肝和肾，用12g助滤剂。把广口瓶连到均化器上，以最大速度混合3min。用安装在过滤装置上的60ml粗烧结玻璃漏斗，通过2g助滤剂垫过滤。收集滤液到100ml刻度瓶，用MeOH冲洗瓶和滤饼到接近100ml。如果滤饼变干，加MeOH时，用刮刀打碎，防止液沟形成。在室温稀释到100ml，盖好，混匀。$$将阴离子交换柱放在氧化铝下边。移取20ml提取物置于氧化铝柱。通过两个柱洗提入烧杯，将10ml MeOH沿边冲洗氧化铝柱。拆除氧化铝柱和烧杯。在阴离子交换柱下方放置25ml容量瓶，用2份10ml含5%HCl的MeOH洗提Clopidol。用MeOH将提取物定容，混匀。移取1ml等分试样放入13×100mm管，在70℃H2O浴中固定管并使管中液面与H2O平面一样高，蒸发到干〔4－5min〕。用橡胶管和医用滴管头，或相当的器具将很小的空气流喷入管。取出管子，加0.2ml 80%MeOH，略加热，再溶解残渣。加1ml 重氮甲烷试剂，用螺旋帽密封，把管子固定在上述70℃H2O浴中微热2min，取出管子，在摘下盖子前冷却5min。加小量SiC沸石片，把管子固定在70度水浴，仅使末端圆底部分接触H2O，缓缓蒸发试剂。继续加热2－3min直到醚蒸发。加0.1ml 1N NaOH，5ml H2O和1.0ml苯，盖好管子，用力摇匀1min。离心3min。必要时再加苯稀释滤液。按E，注入3μl苯层。测量PH〔峰高〕，在标准曲线上内插得到苯提取物中Clopidol的μg/ml。
F.c 回收率
