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动物组织中的甲烯雌醇醋酸盐残留物
动物组织中的药物和饲料添加剂
- 气相色谱法
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A 原理
用CH3CN从瘦组织提取甲烯雌醇醋酸盐〔MGA〕并用已烷分离提取物。用已烷萃取肥组织中的MGA，然后转入CH3CN。用已烷和已烷丙酮(95+5)，在硅酸镁载体上将蒸发溶剂后的两份萃取残渣进行色谱分离，除去干扰类脂物质。用已烷-丙酮(80+20)洗提MGA。残渣溶于已烷-丙酮，并用GC测定。$$对于在色谱上MGA分辨很差的肝样品，蒸发已烷-丙酮，用70%MeOH-已烷分离，转入CHCl3，蒸发。将干燥残渣溶于已烷-丙酮再注入GC柱上。
B 仪器
B.a 匹配器
24/40。
B.b 高速搅拌机
带1L玻璃容器，有聚乙烯密封垫。
B.c 色谱管
玻璃制，400×19mm内径，装有中孔径烧结玻璃圆盘，聚四氟乙烯塞垫和24/20尖端。
B.d 容器
塑料，带盖，贮存冰冻组织。
B.e 烧瓶
圆底50，500和1000ml。
B.f 漏斗
中等孔度径烧结玻璃漏斗，350ml。
B.g 气相色谱仪
F&M 402型，或相当仪器。带有全玻璃柱上注射系统，^63^Ni电子捕获检测器和1mV条形状记录仪。操作条件：温度〔℃〕－柱240－250，注射口240－250，检测器270－275；流速比－He载气60－80ml/min〔转子流量计调节〕。Ag-CH4清洗气(95+5)135－150ml/min；衰减16×或32×；脉冲间隔150；电流表灵敏度对1mV检测器最大偏转1×10^-12^A。在这些条件下，MGA的保留时间约为5－6min。
B.h 气相色谱柱
用硼硅酸盐玻璃管6.00±0.33mm外径和3.00±0.25mm内径。把管子的0.9m段弯成适合仪器设计。用涂有6%OV-17的100－120目Gas Chrom.Q〔最大操作温度350℃，或相当品〕填充柱子。用0.5cm硅烷化玻璃毛松松地塞住两端。要塞得离两端足够远，使得在注射口或检测器入口处内部没有柱填充物或者玻璃毛。将柱子连到注射口，用顶盖盖住检测器的入口。在240℃，He载气为40ml/min，调整柱子1h，然后在275℃，He载气80ml/min老化16h。除去顶盖并把柱子连到检测器上。
B.i 垫圈
聚乙烯，从1L冷冻包装物上剪下。
B.j 柱的氮压力支管
〔任选〕。通过在20.7kPa调节的支管把匹配器与专门的控制阀相连。
B.k 吸液管
移液管。
B.l 接收器
250ml24/40圆底烧瓶。在底部具有24/40凸模接头，或相当器具。
B.m 旋转蒸发器
4－6个小尺寸Rinco蒸发器。或相当器具，用连到支管上的4mm孔塞控制。此支管通到串连在140L/min气流量的真空泵上的2个冷凝阀上。用固体CO2-乙醇混合物冷却阀门。把圆底烧瓶中的各样品和串联到蒸发器上的2个匹配器连接，在恒温控制45℃H2O浴中加热。
B.n 分离器
带聚四氟乙稀垫，500和1000ml。
B.o 硅烷化玻璃毛。
B.p 注射器
10μl。
C 试剂
〔在不加组织进行整个测定时，所有溶液必须不含杂质〕
C.a 氩-甲烷，95+5
清洗气。
C.b 硅藻土。
C.c 硅酸镁载体
60－100目。在650℃活化。使用前在130℃炉内加热不少于48h。
C.d 玻璃器皿清洁剂。
C.e 氦
最低纯度99.5%。
C.f 固体二氧化碳。
C.g 溶剂
丙酮，CH3CN，苯，CHCl3，已烷和甲醇。
C.h 混合溶剂
(v/v)。
C.h.1 已烷-丙酮
(8+2)。
C.h.2 已烷-丙酮
(95+5)。
C.h.3 70%甲醇。
C.i 无水硫酸钠
用CHCl3洗，在110℃炉内干燥，用前一直贮存在玻璃塞瓶中。
D MGA标准溶液
D.a 贮备液
D.a.1 A
1mg/ml；1000 ppm。将100.0mg甲烯雌醇醋酸盐(99.5%纯度)溶于100ml丙酮。溶液可稳定2－3个月。
D.a.2 B
100ppm。用MeOH将10.0ml溶液A稀释至100ml。每天现配。
D.a.3 C
10ppm。用MeOH将10ml溶液B稀至100ml，每天现配。
D.b 中间溶液
D.b.1 D
0.5ppm。用MeOH稀释5ml溶液C到100ml。
D.b.2 E
1.0ppm。用MeOH稀释10.0ml溶液C到100ml。
D.b.3 F
1.5ppm。用MeOH稀释15ml溶液C到100ml。
D.c 工作溶液
0.25,0.5,0.75ppm。将5.0ml溶液D、E和F，分别转入50ml圆底烧瓶，在旋转蒸发器上蒸发。将残渣溶于10.0ml已烷-丙酮(8+2)。
E 萃取
〔用洗涤剂清洗所有玻璃器皿，以H2O冲洗除去痕量清洁剂。然后用MeOH，丙酮或CHCl3漂洗。在冰箱中保存样品〕。
E.a 脂肪提取
将25.0g样品转入250ml烧杯。加150ml已烷。在通风橱内于不沸腾的蒸气浴上加热。用刮刀搅拌直到脂肪溶解，将20g硅藻土放入烧结漏斗，用100ml CH3CN洗。弃去洗液，通过漏斗上的滤饼，将热脂肪溶液抽滤到1L过滤瓶，用不到50ml已烷冲洗烧杯以除去固体物质，转入漏斗。取下顶部3mm硅藻土饼，转入搅拌器杯〔漏斗中剩下一些硅藻土进行下次过滤〕。$$加150ml已烷，低速均化3min。通过硅藻土滤饼将溶液过滤到滤瓶。用足量已烷冲洗搅拌器杯除去固体，转入漏斗。用已烷将滤瓶中合并的滤液调到约400ml。用2份50ml CH3CN冲洗烧杯和搅拌器杯，转入漏斗〔由于MGA可能从已烷中吸附到硅藻土上，应彻底冲洗滤饼〕。在通风橱中于蒸气浴上温垫滤瓶，并把滤液转入1L分离器。用5－15ml CH3CN洗瓶子，也转入分离器。用力摇动1min。使其分层30min。将下层放入1L圆底烧瓶。加100ml CH3CN到分离器。反复萃取分离2次。加50ml苯到圆底烧瓶，在旋转蒸发器上蒸发。
E.b 肌肉、肝和肾的提取
把25.0g冷冻组织转入搅拌杯，室温下融化5－10min。加150ml CH3CN，20g硅藻土和50g无水Na2SO4。低速均化3min。将20g硅藻土放入烧结玻璃漏斗，用100ml CH3CN洗涤。弃去洗液。通过滤饼抽滤到1L滤瓶。用不超过50ml CH3CN冲洗搅拌杯除去残留固体。从滤垫上分离出组织饼转入搅拌器〔不要搅动组织饼下面的硅藻土。普通家用叉子是很好的转移工具〕。$$加10g硅藻土，25g无水Na2SO4和150ml CH3CN到搅拌杯。低速均化3min，过滤，洗涤。合并滤液转入1L圆底烧瓶，加50ml苯。在旋转蒸发器上蒸发到干〔注意：可能发生暴沸〕。为干燥残渣，通过导管加200ml已烷和100ml CH3CN。拆下导管，将混合溶液转入1L分离器。另加200ml已烷到圆底烧瓶，用力摇1min。分层30min。将下层放入1L圆底烧瓶，加100ml CH3CN到分离器。反复萃取分离2次，加50ml苯，在旋转蒸发器上蒸发。
F 柱色谱
分析样品前，按下法用MGA标准液确证已烷-丙酮(8+2)可完全洗提MGA；移取1ml 1ppm MGA标准溶液放入50ml圆底烧瓶，在旋转蒸发器上蒸发。在硅酸镁色谱柱上，如下述。测定MGA回收率。若回收率<95%，确定新的洗提体积或买到新批号硅酸镁载体。$$向19mm内径玻璃管中，用放液器加冷硅酸镁到10cm高。向管中推入1小卷玻璃毛直到接触到硅酸镁，把贮液器放在柱顶，用100ml已烷，100ml丙酮和100ml已烷依次预洗柱子。〔可用N压力加快洗涤〕，拆去贮液器。$$将样品残渣溶于20ml已烷，转到柱顶。替换贮液器依次用20ml已烷，200ml已烷和300ml已烷-丙酮(95+5)洗瓶子，把各份洗液都加到柱上；如果用N压，则加导管。最后的溶液到达柱顶时，在柱下放500ml圆底瓶，用150－170ml已烷-丙酮(8+2)洗样品残渣瓶，转到MGA洗提柱上。洗提样品直到柱子变干，用N压吹出最后溶液。在旋转蒸发器上蒸干。用5份2ml丙酮把干残渣定量转入50ml圆底烧瓶，放在旋转蒸发器上蒸发，用已烷-丙酮(8+2)稀释样品到1.0ml。$$某些肝样品，MGA色谱图分辨不清晰。下列补充的操作除去干扰是必要的。在旋转蒸发器上蒸发1ml已烷-丙酮溶液。加3份20ml已烷到已经干燥的残渣上，转入500ml分离器，加50ml 70%MeOH，用力摇1min，分层15min，把下层放入第二个500ml分离器，加50ml 70%MeOH到第一个分离器。重复萃取分离2次。向第二个分离器中的MeOH层上，加1.0ml标准Na2SO4溶液，100ml去离子H2O和50ml CHCl3。用力摇1min〔注意：多次放气〕，分层15min，把下层放入500ml圆底瓶。加50ml CHCl3到分离器，重复萃取分离2次。在旋转蒸发器上蒸发CHCl3。用5份2ml丙酮将干残渣定量转入50ml圆底瓶，在旋转蒸发器上蒸发。加1.0ml已烷-丙酮(8+2)，再注入柱中。
G 气相色谱
交替注入2－4μl等分样品空白和0.25ppmMGA标准溶液，直到所得标样峰高重现。注射1－4μl 0.25ppmMGA标准溶液。调节气流和衰减，直到得到20－25mm峰高。用该标准溶液来测定和计算约10ppb(ng/g)水平的样品。0.5ppm标液测定约20ppb的样品，0.75ppm标液测定约30ppb的样品。$$注射与所用标样相同体积的样品以得到20－25mm〔或适当的〕响应，用基线技术在MGA保留时间，测量标液峰高H'和样品峰高H。$$ppb MGA＝(H/H')×C×(V/I)/g样品$$注射到柱中的MGA量；式中C＝ng，V＝圆底烧瓶中总溶液〔样品+溶剂〕ml数；I＝注入柱上的样品的毫升数。
