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动物组织中萘啶酮酸残留物
动物组织中的药物和饲料添加剂
- 分光荧光法
- 〔用于含量大于100ppb萘啶酮酸的小鸡肝和肌肉〕
A 原理
萘啶酮酸是用EtOAc从组织水匀浆中提取的。收集含有萘啶酮酸的EtOAc，浓缩并通过氧化铝柱。用硼酸缓冲液从柱上除去萘啶酮酸，酯化，用CHCl3再萃取。除去CHCl3后，用H2SO4使残留萘啶酮酸发荧光，并用分光荧光计测定所产生的荧光。
B 仪器
B.a 分光荧光计
带Xe灯，IP28光电倍增管，用3号狭缝仪控制。在各种仪器之间，精确的激发和发射波长设置可能略有变化。在2ml工作标液〔1μg萘啶酮酸〕和在10ml 21.5N H2SO4，C(c)〔1〕中的残渣溶液蒸发后，测定最佳波长〔约325和408nm〕。
B.b 色谱管
160×11.5〔内径〕mm。
B.c 搅拌器
往复式。
C 试剂
C.a 磷酸盐缓冲溶液
pH6.0。称28gNaH2PO4·H2O放入1L烧杯，加约600ml H2O，用NaOH溶液电位调节pH，稀释到1L。
C.b 硼酸盐缓冲溶液
pH10.00。将30g H3BO3溶于约600ml H2O中，用NaOH水溶液电位调节pH，稀释到1L。
C.c 稀硫酸
C.c.1 21.5N
量200ml H2O放入1L瓶，冷却下缓缓加入300ml H2SO4。在室温下使用溶液。
C.c.2 7N
用2体积水稀释1体积〔1〕。
C.d 氧化铝
中性。
C.e 萘啶酮酸标准溶液
C.e.1 贮备液
500μg/ml。将50.0mg萘啶酮酸分析标样溶于100ml MoOH。
C.e.2 中间溶液
5.0μg/ml。用MeOH稀释2.0ml贮备液到200ml。
C.e.3 工作溶液
0.5μg/ml。用MeOH将100ml中间溶液稀释到100ml。
D 测定
把10g鸡肝或肌肉转入高速搅拌器。加100ml磷酸缓冲液，混合2－3min。将匀浆转入500ml玻璃塞提取瓶，加300ml EtOAc。$$向5个500ml玻璃塞萃取瓶中各加100ml磷酸缓冲液。分别转入0.0,1.0,2.0,3.0和4.0ml工作液，含量分别为0.0,0.50,1.0,1.5和2.0μg萘啶酮酸。各加300ml EtOAc，机械振荡含样品和标样的全部瓶子10－15min，在2500r/min离心约5min。从各瓶抽出250ml EtOAc上层清液分别转入600ml烧杯。在蒸气浴上空气流下蒸发到约60ml。$$如下述制备样品和各标样的吸收柱。把玻璃毛塞放入色谱管底部。加氧化铝〔约3g〕到3cm深。把另一个玻璃毛塞放到柱顶。用25ml EtOAc洗各柱，把组织和标样萃取物从烧杯转到各自柱上。用25ml EtOAc，接着用2份25ml乙醚和2份25ml MeOH洗各烧杯。将各洗液转到相应的柱子，弃去全部流出液。$$加2份25ml硼酸盐缓冲液并将流出液收集在50ml刻度瓶中。将流出液从刻度瓶转到带聚四氟乙烯瓶塞的分离器。用25ml乙醚萃取，弃去醚。用10ml 7N H2SO4酸化水溶液。用25ml和10ml CHCl3充分萃取。抽出各份CHCl3萃取物合并在100ml烧杯中〔不要引入水相〕。在蒸气浴上蒸发至刚刚变干。$$向各烧杯加10.0ml 21.5N H2SO4。充分混匀10min以上。在激发波长325nm，发射波长408nm，1cm比色皿中测定空白的，标样和组织样产生的相对荧光值〔线性刻度仪读数和放大倍数的乘积〕。从所有标样和样品产物的相对荧光值中减去试剂空白相对荧光值。$$以校正试剂空白的相对荧光值为纵坐标，以相应的μg萘啶酮酸为横坐标制备标准曲线。从标准曲线测定与组织样产生的试剂空白－校正相对荧光值相对应的萘啶酮酸量(x)。$$ppb (ng/g)萘啶酮酸＝(x×1000)/10g〔组织重量〕
