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猪组织中磺胺二甲嘧啶残留物
动物组织中的药物和饲料添加剂
- 气相色谱-质谱法
- 〔用于0.05－0.2ppm残留物〕
A 原理
用CHCl3-丙酮从组织中提取磺胺二甲嘧啶。过滤萃取物，蒸发除去溶剂。残渣再溶于已烷，对1N HCl进行分配。中和酸相，用CH2Cl2萃取磺胺二甲嘧啶。除去溶剂并用重氮甲烷使残渣甲基化。用电子捕获气相色谱/质谱(ECGC/MS)以所选择的离子型号鉴定和定量磺胺二甲嘧啶。6种离子，m/z92，98，227，228，233和234被检测。通过GC运行累积各离子流。贮存在磁带上，并按离子流对时间作图。鉴别离子流图中出现的峰，计算保留时间和各峰面积，从已知标准溶液分析数据，用最小二乘线性回归制出的标准曲线上定量磺胺二甲嘧啶。以在适当的相对丰度于适当保留时间出现的显著离子的存在来确证磺胺二甲嘧啶。$$方法给出定量结果和证实被检定残留物的数据。方法准确度在0.1ppm水平，具有期望的4.6%的变异系数。最低检测量是0.002ppm。为了适合超过0.2ppm的残留物，重新建立标准曲线如下：$$$T期望浓度范围/使用标样(ppm)A/使用标样(ppm)B/使用标样(ppm)C$$0－0.2ppm/0.05/0.10/0.20$$0.2－2.0ppm/0.50/1.0/2.0$$2.0－20.0ppm/5.0/10.0/20.0$T
B 仪器
B.a 搅拌器
带500ml瓶。
B.b 蒸发器。
B.c 气相色谱-质谱仪
Hewlett-Packard 5992型在多重离子检测中按下列条件操作：电子能量，70eV；电子倍增器，2000－2800eV；源温度，140℃；积分时间，200ms/检测质量。柱：2mm内径×3ft，填充3%OV-17，80－100目Gas-Chrom Q〔或相当的填充剂〕玻璃柱。气色条件：注射口230℃；柱220℃；He气流速30ml/min；GC/MC界面，〔聚〕硅氧烷薄膜分离器。总分析时间约17min。磺胺二甲嘧啶保留时间9－12min。
C 试剂
C.a 溶剂
在玻璃瓶或相当的容器中蒸馏：再酮；CH2Cl2；乙醚；MeOH〔用无水Na2SO4摇匀并一起存放〕；CH3Cl〔无防腐剂〕。
C.b 柠檬酸钠溶液
加720g二水合柠檬酸钠到1L H2O中。
C.c 重氮甲烷
根据说明书制备。注意：在通风橱中于保护屏或屏蔽板后面制备重氮甲烷。戴手套防止皮肤接触试剂。重氮甲烷有毒，而且在某些条件下易爆炸。新制的重氮甲烷溶液是金黄色的。低于0℃存放在冰箱中。贮存时间可因制备方法不同而不同。
C.d 磺胺二甲嘧啶标准贮备溶液
100μg/ml。准确称10.0mg磺胺二甲嘧啶，放入100ml容量瓶。用无水MeOH溶解，定容。
C.e 工作标准溶液
5μg/ml。移5ml贮备标液放入100ml容量瓶，用H2O定容。每周新配标液。
C.f GC/MS标准溶液
50μg/ml。准确称10.0mg无标记磺胺二甲嘧啶放入200ml容量瓶。用无水MeOH溶解，定容。
C.g ^13^C-标记磺胺二甲嘧啶标液
50μg/ml。准确称10mg ^13^C-标记磺胺二甲嘧啶放入200ml容量瓶。用无水MeOH溶解，定容。
D 萃取和清洗
称25g(±0.1g)磨细的冷冻组织放入250ml离心瓶。选择空白样品作参比。用1ml工作标准溶液(5μg/25g＝0.2ppm)加入第二个空白样品使成0.2ppm。每套平行分析2个空白。$$加100ml丙酮，洗下粘在离心瓶壁上的组织，然后用组织研磨机搅拌1min。在2000r/min离心10min。通过24cm Whatman 2V滤纸，将丙酮萃取物过滤到500ml圆底烧瓶。加10ml 5N HCl到丙酮萃取物中，放在55±5℃浴中的旋转蒸发器上，蒸发到丙酮味消失。$$用2份25ml乙醚把剩余酸相转入125ml分离器。缓慢旋转分离器1min，相分离30min，把酸相转入100ml烧杯。加50ml饱和柠檬酸三钠水溶液。用10N NaOH调整pH到6.0－6.5。把烧杯内容物转到250ml分离器，加30ml CH2Cl2，摇2min。相分离，将10ml CH2Cl2相转入15ml离心管，在45℃N蒸气下蒸发到干。
E 薄层色谱板
在0.1ml MeOH中溶解残渣，全部样品转入100μl注射器，放到自动TLC测位仪上。与10μl TLC定位标准溶液〔100ng〕同时在TLC板上定位。用CHCL3-叔丁醇(80+20)，室温，展开10cm。从槽上取下板，室温风干10min，用含1%亚硝酸钠的1.0N HCl喷雾板。用吹风或在100℃炉内干燥。用0.4%NEDA和MeOH喷雾。如上干燥，产生粉红色斑点。与标样比较Rf值以鉴定。如果TLC结果是正的，继续进行下面的GC/MC。
F GC/MS定量/确认
称50.0g(±0.1g)磨细的冷冻组织放入500ml搅拌瓶。选择空白组织为参比。用无标记磺胺二甲嘧啶(100μl GC/MS标准〕加入第2个空白组织样品使用达0.1ppm水平。用^13^C-标记磺胺二甲嘧啶标准溶液〔100μl 〕加到所有样品使达0.10ppm水平。$$向瓶中加100ml CHCl3-丙酮(1+1)。低速搅拌1min。轻轻倒出清液，用24cm Whatman 2V波纹滤纸过滤液体〔不抽真空〕到1L圆底瓶中。$$反复萃取过滤2次以上，在第三次提取后把全部组织转到滤纸上。$$用约25ml CHCl3-丙酮洗瓶子，把洗液转到滤纸上使其沥干。用3份20ml等分CHCl3-丙酮(1+1)洗滤纸和内容物。如果合并滤液不清，再过滤并用约20ml CHCl3-丙酮洗滤纸。$$在55℃〔±5℃〕旋转蒸发器上蒸发到油状残渣〔约1－2ml〕。立即从旋转蒸发器上取下。依序用4份25ml已烷，2份3ml丙酮和2份25ml已烷将残渣定量转入分离器。加10ml 1N HCl到分离器。轻摇2min放置分离。分离器放入60℃H2O浴可消除乳化现象。再用5ml 1份的1N HCl萃取3次。放出酸相，把滤液合并在125ml分离器中。向125ml分离器加3.0ml 10N NaOH混合。用pH纸试pH。若pH不是12－13。再加10N NaOH，混合使达此pH。$$加25ml CHCl3到底液中，摇1min，相分离完全。弃去CHCl3。再用CHCl3萃取第2次，弃去CHCl3。将水相定量转入小烧杯〔约100ml〕。加25ml柠檬酸三钠饱和水溶液缓冲。根据需要加入NaOH或HCl，用pH计调节pH到5.55－5.65。$$定量转移烧杯内容物到125ml分离器，加15ml CH2Cl2，摇动1min。使相分离，并把CH2Cl2转入50ml锥形离心管。检查水相pH值，如果必要再调到5.55－5.65。再用CH2Cl2反复萃取2次。$$在氮蒸发器的氮气流下，45℃时蒸发离心管内容物到干。用1ml无水MeOH溶解残渣。加1ml重氮甲烷溶液，用涡旋混合器混合，室温放置5min，从管中转移溶液到15ml或更小的浓缩管，在氮蒸发器的氮气流下，45℃蒸发到干。将甲基化的残渣溶于200μL无水MeOH。
G 标准曲线制备
向3个15ml浓缩管中各加100μL^13^C-磺胺二甲嘧啶标准溶液〔50μg/ml〕。在管上标明A、B和C。向管A加50μl GC/MS标准溶液〔50μg/ml〕〔相当于0.05ppm^12^C〕。向管B加100μl GC/MC标准溶液〔50μg/ml〕〔相当于0.10ppm^12^C〕。向管C加100μl GC/MC标准液〔50μg/ml〕〔相当于0.20ppm^12^C〕。向各浓缩管中各加1ml新制备的重氮甲烷溶液。用涡流混合器混合，室温放置5min，在氮蒸发器上氮气流下，于45℃蒸发到干。将各甲基化残渣溶于200ml无水MeOH。$$设定选择离子检测器〔SIM〕测量数据程序范围如下：$$$Ta/质量/1＝227，/保压时间/＝200/ms$$b/质量/2＝228，/保压时间/＝200/ms$$c/质量/3＝233，/保压时间/＝200/ms$$d/质量/4＝234，/保压时间/＝200/ms$$e/质量/5＝92，/保压时间/＝200/ms$$f/质量/6＝98，/保压时间/＝200/ms$$g/溶液洗出时间＝1.1min/ / / / $T按下面给定顺序进行注射$$a注射2.0μL标样A$$b注射2.0μL标样B$$c注射2.0μL标样C$$对各次标准注射，测定m/z227和m/z233峰面积比。用最小二乘法，计算227/233质量比对于加到各标样的无标记磺胺二甲嘧啶的量〔可能表示为根据50g样品测出的ppm〕的标准曲线。用类似方法，计算各标样的下列确定比：228/227和234/233。为确证在处理样品中检测的磺胺二甲嘧啶，将用从3次标准注射计算的228/227和224/223比值的平均值。
H 测定
按标准曲线制备中设定SIM程序，注射各待分析样品2.0μl。在每次运行结束时绘出重现的离子流图像，计算227/233离子质量比。从标准曲线上读取样品的磺胺二甲嘧啶含量。$$为了鉴定：(a)无标记磺胺二甲嘧啶样品必须与加^13^C-标记的磺胺二甲嘧啶共同洗提。(b)来自无标记碘胺二甲嘧啶的m/z92，277和228与来自^13^C-标记的磺胺二甲嘧啶的m/z98，233和234必须都存在。(c)样品中228/227和234/233离子的比值应在对标样测得的平均比值的10%以内。
