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动物组织中的磺酰胺残留物
动物组织中的药物和饲料添加剂
- 薄层色谱屏蔽法
- 〔用于猪，火鸡和鸭组织〕
A 原理
在加入内标磺胺吡啶后，用乙酸乙酯萃取磺酰胺。利用有机溶剂和水溶液之间的分配，净化萃取物，并在硅胶TLC板上进行色谱分离。用荧光处理发色板，并用荧光光度计扫描。
B 试剂
B.a 乙酸乙酯，已烷，二氯甲烷和甲醇
在玻璃仪器中蒸馏。
B.b 甘氨酸缓冲溶液
制备0.2M甘氨酸水溶液，用NaOH调节pH到12.25。
B.c 荧光胺衍生溶液
溶解25mg荧光胺于250ml丙酮。处理8－9板后，换溶液。
B.d 磺酰胺标样
市售磺胺二甲嘧啶〔SMZ〕，磺胺二甲氧哒嗪〔SDM〕，磺胺喹[口恶]啉〔SQX〕，磺胺[口塞]唑〔STZ〕，磺胺溴代二甲嘧啶〔SBR〕和磺胺吡啶〔SPY〕。
B.e 贮备标准溶液
溶解100mg磺酰胺于100ml丙酮，保存于冰箱中。
B.f 增强标准溶液
用0.05M pH7.5的磷酸缓冲液将有关的磺酰胺会合，稀释到5.0,2.50和1.25μg/ml〔相当于在组织中含0.2,0.1和0.05ppm)。全部溶液应包含2.5μgSPY/ml。在冰箱中保存增强标准溶液，且每周新制备。
B.g 内标
用贮备标准溶液(e)制备2.50μgSPY/ml 0.05M pH7.5磷酸缓冲液。
C 仪器
C.a 密度计
CAMAG TLC/HPTLC扫描仪。激发源装有400nm干涉滤波器。用500nm干涉滤波器代替光电倍增管上的标准400nm截波器。狭缝范围7.8×0.3mm，在1或2mm/s扫描板。
C.b TLC板
20×20cm凹槽板。形成8mm宽的槽，带有0.25mm硅胶层和预吸附斑点区。
C.c TLC配套毛细管
20μl玻璃毛细管。
C.d 加热条板
设定85℃自动定位的加热条板，可用任何与此相当的有温控的加热装置代替。
C.e TLC槽
标准双沟槽，衬饱和垫完全饱和大气。
C.f 衍生槽
不锈钢。
C.g 蒸发器。
C.h 均化器。
C.i 搅拌器
卧式往复振荡装置，设置约240次/min。
C.j 离心机
设置2500r/min运行5min或相当器件。
C.k 聚丙烯离心管
50ml容量。
D 样品萃取
准确称约2.5g均化的肝或肌肉放入50ml离心管。加100μl内标准液。制备3个参比样品〔用已知不含磺酰胺的组织〕，加入内标(0.1ppm)和各控制在0.05,0.10和0.20ppm的磺酰胺。等15min后加25ml乙酸乙酯。用组织粉碎机和离心机切磨肌肉样品。对肝样品，盖紧管子，在均化振荡器上摇20min，离心。把乙酸乙酯转到清洁管，弃去组织。加10ml甘氨酸缓冲液到萃取物，机械振荡5min，离心。真空抽出并弃去有机相。加2ml 2M ph5.25磷酸缓冲注和1.7M HCl的(1+1)混合液调水相pH到5.2－5.3。检查pH，加缓冲液或0.1N NaOH进行最后的调节。加5ml已烷，机械振荡5min，离心。抽出并弃去已烷相。除去留在界面的任何固体或乳化物质。加10ml CH2Cl2，摇5min，离心。抽出并弃去水相。加10μl二乙胺到CH2Cl2萃取物，在40℃N气流下浓缩刚好到干。蒸发时不时用CH2Cl2淋洗管壁。将残渣溶于100μl MeOH，在涡流混合器上混合30s，在进行色谱分析前放置5min，使不溶油类沉降。
E 色谱
向TLC板的预吸收定位区点一份20μl样品。避免使用板各边的狭道，把3个加标参比样品定位在横穿板的间隙上使板的横向变化影响最小。在MeOH中展开板1cm，接着在CHCl3-tert-BuOH(80+20)中进行6cm和12cm的2个展开。在各展开之间，在110℃干燥板1min。如果STZ可疑或存在，用H2O预洗CHCl3-tert-BuOH。为了倍增磺酰胺优化其分辨，保持展开槽的温度在30－33℃。迅速将板浸入荧光胺溶液中以衍生化合物。15－30min后，可见到谱带，扫描各窄条并得到它的响应扫描曲线。对每一个样品和标样测定有关的磺酰胺响应与内标响应的比值。
F 计算
对各磺酰胺，利用线性回归和3个加标样品的结果，计算浓度对响应比的标准曲线的斜率和截距。标出y轴上磺酰胺浓度，得出ppm量纲的标准偏差估计值(S^^y,x^^)，从而简化置信区间的估算。对于质量保证而言，S^^y,x^^应小于等于0.02ppm，相关系数r应大于等于0.995，用线性回归斜率和截距，从样品各自磺酰胺/内标峰高比计算样品浓度。
